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拟南芥铵转运蛋白AtAMT1;1基因的转录后调控机制研究

张永建  
【摘要】:作为土壤中重要的无机氮源之一,铵态氮可以被植物根系优先吸收和利用,但过量的铵会对植物造成毒害。因此,为了应对外界铵供应强度和自身氮营养状况的变化,植物需要对根系的铵吸收过程严格调控。前期研究发现,负责拟南芥根系高亲和铵吸收的AtAMT1;1基因可能存在转录后调控,转录本的稳定性在不同组织器官和氮营养状态下存在显著差异,其调控机制并不清楚。本研究旨在利用分子生物学、遗传学以及高通量测序等手段,深入解析铵转运蛋白AtAMTl;1基因在转录后水平上的分子调控机制,为阐明植物氮素吸收的调控机制、创建氮高效转基因作物提供理论依据。主要研究结果分为两部分:1.AtAMTl;1转录本在拟南芥根中的稳定性调控我们在atamt1;l-1(koll)背景下利用35S启动子驱动AtAMTl;1基因表达,在转基因植物根中AtAMTl;1转录本不能稳定表达,并且伴随着AtAMTl;1基因相关小RNA的产生。通过与小RNA产生途径突变体rdr6-11遗传杂交,证实AtAMTl;1转录本在根中的降解是依赖RDR6的小RNA参与的转录后基因沉默(PTGS)。35S启动子驱动GFP报告基因的表达不能产生PTGS,而AtAMTl;1基因ORF区域与GFP基因序列融合后则会引发PTGS,表明AtAMTl;1基因的ORF序列起到关键作用。进一步通过转基因或遗传杂交对PTGS系的遗传背景(koll)和启动子(35S)进行替换,可以使AtAMT1;1基因在根中的表达稳定,表明koll背景和35S启动子的互作可以引发AtAMTl;1基因PTGS的发生。通过高通量测序分析发生沉默的转基因系根中小RNA的变化发现,大量的小RNA在AtAMTl;1基因位点累积,并且与AtAMT1;1基因序列特性有关。对AtAMTl;1基因特有的两个位点进行突变,转基因植物根中小RNA产生被抑制,从而阻止PTGS发生。以上结果表明,AtAMT1,.1基因的PTGS过程受到koll背景、35S启动子和AtAMTl;1自身基因序列特性的影响。同时,依赖于RDR6的PTGS发生机制进一步暗示,三者的互作通过aberrant RNA通路引起S-PTGS。2.AtAMT1;1转录本的氮调控通过分析AtAMTl;1基因的“功能获得”突变体和在根中稳定表达的UBQ启动子驱动转基因材料,我们发现即便是组成型转录,根和地上部中AtAMTl;1转录本的积累在缺氮条件高于正常供氮,说明转录后氮调控模式的存在。分析两个T-DNA插入造成截短AtAMTl;1基因表达的突变体材料发现,带有ORF的3'-末端207 bp序列就会在转录后水平受到氮调控。将不受转录后氮调控的GFP基因与207 bp序列融合表达,发现融合基因具有转录后氮调控模式。通过5'-RACE对AtAMT1,.1基因在供氮条件下的降解产物进行扩增,在基因ORF 3'端发现一个主要的作用位点+1458,并且该位点突变的AtAMTl;1转录本不再受转录后氮调控作用。尽管高通量测序并未发现作用该位点的小RNA,但是利用+1458位置的特异探针的分子杂交发现一个大小约30-100 nt非编码RNA(S21),并且在供氮条件下大量表达,与AtAMTl;1转录本的累积模式相反,推测S21可能参与AtAMTl;1基因转录本的降解过程。以上结果说明,AtAMTl;1基因在根中受到特异的转录后氮调控,这一过程与ORF 3'端207 bp的序列有关,而非编码RNAS21可能参与其中。综上所述,本研究证实植物根中AtAMTl;1基因存在转录后沉默和氮调控过程,并在分子水平阐明内在的作用机理,为理解植物根系铵吸收的调控提供了新颖的调控机制。


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