PVY HC-Pro和CP蛋白与烟草叶绿体蛋白互作的生理功能研究

【摘要】：病毒感染会对植物的形态、生理、生化以及代谢过程产生巨大的影响,引发变色、坏死等严重症状。叶绿体作为植物能量代谢及物质代谢的重要场所,是病毒攻击的首要目标。早期研究发现病毒感染过程中叶绿体的结构严重扭曲畸形,生长发育停滞,同时伴随着光合作用降低以及内部代谢途径的紊乱。这些研究主要集中于病毒感染晚期植株症状描述,相关生理指标的检测以及部分叶绿体内酶活性的测定,而关于侵染早期病毒影响叶绿体结构与功能的分子机制研究较少。在前期研究的基础上,本文对病毒感染早期叶绿体生理功能变化的分子机制进行了细致分析。本研究对感染马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)烟草的叶绿体相关生理指标进行了检测,发现在病毒感染早期光合速率及叶绿素和类胡萝卜素含量均没有明显的变化;但是感病本生烟草中ABA含量却显著提高,同时一些ABA效应基因(ABI3,ABI5和RAB18)表达上调。由此推测PVY感染可能影响叶绿体内类异戊二烯物质合成途径——甲基赤藓糖醇磷酸(2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate,MEP)途径。本实验室前期研究发现 PVY HC-Pro 蛋白与烟草MEP途径的关键酶1-脱氧-5-磷酸木酮糖合酶(NtDXS)互作。在此基础上,本研究利用pull down实验再次验证了二者的互作关系;并通过体外酶活性分析实验证明PVY HC-Pro可以促进NtDXS的合酶活性。为了探索这一互作的生理功能,本研究构建转化载体并获得了TP/HC-Pro转基因本生烟植株,HC-Pro蛋白定位于转基因烟草叶绿体内。在稳定表达的T4代转基因本生烟中检测相关类异戊二烯物质的含量,发现叶绿素和类胡萝卜素的含量均显著增加,ABA水平及其效应基因(ABI3,ABI5和RAB18)的表达水平均显著上调。综合以上结果我们认为在马铃薯Y病毒感染早期HC-Pro蛋白通过促进NtDXS的合酶活性激活质体内MEP途径,提高植物体内ABA水平,加快病毒的系统性扩散。前人的研究发现PVY CP蛋白也可以定位于植物叶绿体内,并在感染过程中发挥着巨大的作用。本研究通过酵母双杂交实验发现马铃薯Y病毒CP蛋白可以与铁氧还蛋白/硫氧还蛋白系统(Fdx/Trx system)内组分硫氧还蛋白ATHM2、ATY2和ATHZ,铁氧还蛋白ATFD5以及铁氧还蛋白:硫氧还蛋白还原酶的催化亚基FTRB的全长蛋白互作;推测CP可能通过影响它们的转运和Fdx/Trx系统的组装扰乱叶绿体内氧化还原平衡及新陈代谢过程。本研究还通过酵母双杂交和pull down实验发现并验证PVY CP还可以与烟草中质体编码的RNA聚合酶(PEP)复合体的重要结构组分NbTRXzm和NbFLN1互作;进一步的体外酶活性分析发现PVY CP可以抑制NbTRXzm二硫化物氧化还原酶活性。我们猜测PVY CP可能通过改变NbTRXzm氧化还原酶活性,破坏其与NbFLN1的互作结合;进而可能干扰叶绿体内基因转录复合体的装配,影响叶绿体基因表达及生长发育。本研究利用生物化学与分子生物学技术揭示了病毒蛋白HC-Pro、CP与寄主蛋白的互作对植物叶绿体生理功能及生长发育的影响,初步解析了病毒感染引起叶绿体结构功能变化的分子机理,加深了我们对植物与病毒互作关系的认识。