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拟南芥MTOPVIB与PRD1互作参与减数分裂重组DNA双链断裂的形成

唐雨  
【摘要】:在显花植物(phanerogams)的有性生殖过程中,雌蕊胚珠和雄蕊花药中的性母细胞(2n)经减数分裂分别形成大孢子(n)和小孢子(n)后,进一步发育分别形成雌配子体(胚囊)和雄配子体(花粉)。减数分裂是雌、雄配子体形成的关键步骤,包括DNA复制、姐妹染色单体黏连、同源染色体配对、联会、重组和分离等一系列重要的生物学事件,任何环节出现异常,都会影响雌雄配子体的形成,导致植物不育。其中,同源染色体重组是遗传信息交换的重要方式,而DNA双链断裂(DNA double-strand break,DSB)的形成是同源重组起始过程,目前已发现几个蛋白参与调控拟南芥DSB的形成,其中AtSPO11-1和AtSP011-2是SPO11的同源蛋白;AtPRD1是与小鼠中MEI1同源但功能未知的蛋白;AtPRD2是小鼠和酵母中Mei4的同源蛋白;AtPRD3和AtDFO是植物所特有但功能未知的DSB形成蛋白。虽然已发现这几个蛋白参与DSB形成过程,但对DSB形成过程的遗传调控机制还缺乏深入了解。因此,研究植物雌、雄配子体的形成以及同源染色体重组的分子遗传机制不仅可以了解植物生殖发育的分子遗传机制,也可为农作物遗传育种提供遗传学方面的理论参考。本研究分离鉴定到了影响拟南芥雌雄配子体发育的突变体mt187,该突变体是一个从基因陷阱(gene-trap)和增强子陷阱(enhancer-trap)Ds插入突变体库中筛选到的。与野生型相比,它的角果短小,育性降低。遗传分析显示,mt187突变体中的Ds插入位点与表型不连锁。图位克隆技术分析显示,突变位点位于At1g60460基因的第八个外显子的最后一个碱基(G1890),该位点G1890A突变造成相关内含子的剪切异常,从而影响该基因的正常表达,并严重影响雌雄配子体的形成,导致植物的育性显著降低。另外,从拟南芥生物资源中心(ABRC)获得的T-DNA插入等位突变体也具有相似的表型。这些研究结果表明,At1g60460基因在雌雄配子体的形成中起重要作用。At1g60460基因编码一个最近被命名为MTOPVIB的蛋白。鉴于已有两个相关的等位突变体,因此把mt187改名为mtopVIB-3。上述T-DNA插入等位突变体与发表在Science中的mtopVIB-2是同一个突变体。相对于mtopVIB-3,T-DNA插入突变体mtopVIB-2具有更严重的表型,其结实率仅有2%。初步观察发现,不仅mtopVIB突变体花药中的四分体发育异常、花粉败育,而且它的胚珠中的雌配子体发育也异常,停滞在FG1期大孢子母细胞时期,暗示可能是雌雄配子体发育过程中的减数分裂过程出现异常。进一步利用染色体展片方法观察发现,与野生型的雄和雌性母细胞减数分裂相比,在粗线期,mtopVIB突变体的染色体没有呈现正常的粗丝状;在终变期,突变体出现单价染色体,而不是正常的五对二价体。同时通过FISH实验和免疫荧光实验证明,突变体的染色体配对、联会出现异常。通过计算突变体的重组率,发现突变体的重组率较野生型显著地下降,表明mtopVIB突变体的同源重组也异常。将表型严重的mtopVIB-2突变体与DSB修复缺陷突变体Atcom1-1、Atrad50-1、Atrad51和Atmre11-1构建相应的双突变体,这些双突变体的表型与mtopVIB-2突变体的表型相似,均在减数分裂过程中出现单价体,表明mtopVIB-2确实影响DSB的形成,说明MTOPVIB参与减数分裂DSB的形成过程。Real-time PCR分析表明,MTOPVIB呈组成型表达,在花序中表达量较高。MTOPVIB蛋白属于一类保守性较高的蛋白,其结构与Topo VI型复合体的B亚基相似,其N端含有一个可以结合并水解ATP的Bergerat结构域,C端含有一个可以诱导构象变化的Transducer结构域。Y2H和BiFC实验结果表明,MTOPVIB蛋白可以分别与AtSPO11-1和AtSPO11-2蛋白互作,而且Y3H和BiFC实验显示,MTOPVIB蛋白可以同时与它们互作,暗示三者间可能形成一个Topo VI类似复合体。Y2H和BiFC实验还表明,AtPRD1可以分别与MTOPVIB和AtSP011-2互作,说明AtPRD1可以与Topo VI类似复合体的各成员互作。利用同样的方法还发现AtPRD1蛋白还可以分别与AtPRD3和AtDFO蛋白互作。此外,Y3H和BiFC实验显示AtPRD1蛋白可以介导与AtPRD3和AtDFO蛋白的互作。这表明AtPRD1很可能是DSB形成过程中的一个重要蛋白。综上所述,在拟南芥中,MTOPVIB蛋白与AtPRD1蛋白互作,并与AtSPO11-1、AtSP011-2、AtPRD3和AtDFO等蛋白共同参与拟南芥雌雄配子体减数分裂过程的DSB形成过程。这些结果为了解拟南芥减数分裂DSB形成的机制提供新的实验证据。


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