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奶牛乳房炎源性浅绿气球菌的表型、基因型和致病机制研究

刘钢  
【摘要】:奶牛乳房炎是奶牛的一种常见疾病,在世界范围内给奶牛养殖业带来了巨大的经济损失。病原微生物对乳腺的感染是奶牛乳房炎发生的主要原因,目前已报道的病原菌已经超过150种。浅绿气球菌作为一种环境微生物最早被认为是奶牛皮肤上的共生菌,但近年来多个国家报道从临床和亚临床奶牛乳房炎的奶样中分离到了这种细菌。但是至今为止这种细菌对奶牛乳腺致病性的强弱,以及它对奶牛乳腺免疫反应的影响尚不清楚。因此本研究旨在对我国牛场亚临床乳房炎中分离的浅绿气球菌进行表型和基因型分析,通过体内和体外试验阐明浅绿气球菌对奶牛乳腺健康的影响以及作用机制。本研究从北京、天津和河北的19个牛场采集了 1008份亚临床乳房炎奶样,鉴定奶样中的病原微生物,获得浅绿气球菌菌株,进行生化试验和药物敏感性试验,并利用16SrRNA基因测序、脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)分型和随机扩增多态性DNA标记(random amplified polymorphic DNA,RAPD)分型三种方法进行亚型分析。结果表明:从10个牛场中分离到60株浅绿气球菌,在亚临床乳房炎病例中分离率为5.9%。生化结果显示:浅绿气球菌具有较高的表型多样性,其中触酶试验和VP试验结果与其他国家报道的结果有差异;药物的最小抑菌浓度说明大部分菌株(95.0%)均对β内酰胺类药物敏感,超过半数的菌株对链霉素、四环素、克林霉素和复方新诺明耐药。16SrRNA基因分型将60株菌分为两个亚型,分型能力较弱;PFGE和RAPD分型能将浅绿气球菌分成多种亚型,且RAPD分型方法更适合菌株来源的追踪,能将大部分来自同一牛场或地区的菌株划分为同一亚型。浅绿气球菌亚型分析表明我国牛场来源的浅绿气球菌具有较高的基因多样性。根据RAPD的分型结果,从9个主要亚型中随机各选取1株菌进行小鼠致死性试验。选出强毒株和弱毒株各1株,通过LDH试验分析浅绿气球菌强、弱菌株对奶牛乳腺上皮细胞(bMECs)的细胞毒性,并研究该菌对bMECs粘附性和侵袭能力,利用扫描和透射电镜观察浅绿气球菌强、弱毒株对bMECs形态和结构的影响。结果表明:9株浅绿气球菌中,菌株A.V.40(强毒株)对小鼠致死率显著高于其他菌株,达90%;其余8株菌株对小鼠致死率均低于40%,其中菌株A.V.36(弱毒株)最低,只有10%。强毒株对bMECs具有较强的细胞毒性,攻菌6h后LDH水平显著高于对照组,而弱毒株的细胞毒性较弱。另外,强毒株对bMECs有很强的黏附性,攻菌30 min后即有10%的细菌黏附至细胞表面,2 h后细菌黏附已经超过50%;强毒株还具有一定的侵袭能力,攻菌6 h后,9.7%的细菌侵袭至细胞内部;而弱毒株的黏附力和侵袭力极弱。扫描和透射电镜观察:强毒株在短时间内大量黏附至细胞表面,损伤细胞微绒毛,进而损伤细胞膜和侵袭至细胞内部,线粒体和内质网出现肿胀和空泡化,细胞核出现完全空泡化,细胞的形态结构最终消失。利用荧光定量PCR检测bMECs受到浅绿气球菌感染后细胞内Toll样受体和主要细胞因子mRNA的表达量。实验结果显示:强毒株攻菌3 h内,TLR-2和IL-6 mRNA水平显著升高,而TLR-4、IL-1β、IL-8和TNF-α的mRNA水平都在3-6h显著升高;头孢噻呋治疗能够显著降低大部分Toll样受体和细胞因子mRNA的表达量。弱毒株组细胞中Toll样受体和细胞因子的mRNA也有少量升高,但远低于强毒株组。建立浅绿气球菌感染的小鼠乳房炎模型,从体内试验的角度比较该菌强、弱毒株的致病性以及头孢噻呋和环丙沙星的治疗效果。结果表明强毒株浅绿气球菌能够在小鼠乳腺中保持103CFU/乳腺的细菌水平,病理切片结果显示强毒株引起小鼠乳腺强烈的炎性反应,大量炎性细胞浸润,在第9天时乳腺组织完全被破坏,乳腺组织中TNF-α含量升高;而弱毒株引起的炎性反应相对轻微,乳腺结构完整。高剂量(30 mg/kg)头孢噻呋和环丙沙星的杀菌效果明显,能显著降低乳腺组织中的细菌数量,保护乳腺组织。综上所述,浅绿气球菌在我国北京、天津和河北地区牛场亚临床乳房炎病例中有一定的分离率,占5.9%,具有较多的表型和较高的基因型多样性。强毒株能够黏附、侵袭和损伤bMECs,引起bMECs免疫系统的强烈应答反应;并且能够引起小鼠乳腺的剧烈炎症反应,损伤乳腺组织,但是抗生素治疗效果较好。而弱毒株则对bMECs和小鼠乳腺组织危害较弱。本研究的实验结果表明浅绿气球菌部分菌株对bMECs和小鼠乳腺具有很强的致病性,说明这些强毒株也能够引起奶牛乳腺感染和引发炎症,损伤奶牛的泌乳功能;但是这一推论尚需要建立浅绿气球菌奶牛乳房炎模型来验证。至此,我们分离鉴定我国19牛场中的浅绿气球菌60株,并对该菌的基因型和表型进行分析,还从体内试验和体外实验阐明浅绿气球菌强毒株对bMECs和小鼠乳腺引起损伤和出现免疫应答反应。本研究率先研究浅绿气球菌对奶牛乳腺健康的影响,为进一步科学研究浅绿气球菌奠定了良好的基础,也为浅绿气球菌性奶牛乳房炎的防治提供了科学依据。


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