敖汉苜蓿小花与种子响应硼胁迫的蛋白质组学与代谢组学分析

【摘要】：硼是紫花苜蓿必需的微量元素之一,它能促进紫花苜蓿生殖器官的正常发育,有利于开花结实,对提高苜蓿种子产量和质量的作用不可估量。苜蓿对硼的需求在适量和过量之间的界限很小,施用不当会使苜蓿中毒从而降低种子产量。因此开展紫花苜蓿硼营养机理以及紫花苜蓿生殖器官响应硼胁迫的机制研究,有助于实际生产过程中合理使用硼肥,有效提高苜蓿种子产量。本论文在实际生产实验的基础上,以敖汉苜蓿小花和种子为实验材料,应用蛋白质组学和代谢组学技术,研究硼胁迫下蛋白质及小分子代谢产物的变化及代谢途径,探索紫花苜蓿生殖器官响应硼胁迫的应答机制。主要研究内容如下:1.选用0、0.04、0.08、0.12和0.16%浓度的硼,对生长第二年的敖汉苜蓿进行施肥实验。结果表明,施硼肥有效提高紫花苜蓿小花花粉数量、花粉活力、种子产量、产量构成因子及种子质量。总体上,0.08%浓度处理组的效果较好,增产效果显著。而0.12%处理组存在落花现象,从而降低种子产量。当喷施浓度达0.16%时,已产生毒害作用。因此选择0.00%浓度作为缺硼处理,0.08%浓度作为最适施肥量,0.16%浓度作为高硼处理进行下一步研究。2.测定了 0%(缺硼)、0.08%(对照)和0.16%(高硼)硼处理的敖汉苜蓿小花与种子的抗氧化酶活性、MDA、脯氨酸和可溶性糖含量。测定结果表明,在缺硼胁迫下敖汉苜蓿小花与种子的抗氧化酶活性、MDA和脯氨酸含量均有不同程度的下降。在高硼处理下敖汉苜蓿种子抗氧化酶活性和MDA含量增加,而脯氨酸和可溶性糖含量下降。高硼胁迫对敖汉苜蓿小花的影响不大,但对种子造成一定的影响。3.运用2-DE技术对0%、0.08%和0.16%硼处理的敖汉苜蓿小花与种子蛋白质进行分离,并用PDQuest图像软件、LC-MS/MS质谱技术、Mascot软件和Uniprot数据库进行分析鉴定。在缺硼胁迫下从敖汉苜蓿小花中成功鉴定出12个差异蛋白,主要参与碳水化合物代谢和脂质代谢。从种子中成功鉴定出11个差异蛋白,主要参与碳水化合物代谢和氨基酸代谢。在高硼胁迫下从敖汉苜蓿小花中共筛选出14个差异蛋白,主要参与碳水化合物代谢、氨基酸代谢、脂质代谢和次生代谢。从种子中共筛选出11个差异蛋白,主要参与了氨基酸代谢、碳水化合物代谢和脂质代谢。敖汉苜蓿小花酰基蛋白硫酯酶在缺硼和高硼胁迫下均下调表达,敖汉苜蓿种子NAD依赖的醛脱氢酶家族蛋白在缺硼和高硼胁迫下均上调表达。NAD(P)结合罗斯曼折叠蛋白在高硼处理的紫花苜蓿小花与种子中均表达,是紫花苜蓿响应硼毒害的关键调控蛋白。4.利用GC-MS技术,对缺硼和高硼胁迫下敖汉苜蓿小花与种子进行代谢物谱分析。采用OPLS-DA模型第一主成分的VIP值(阈值1)结合单维统计(t检验)的p值(阈值p0.05)寻找差异性表达代谢物。在缺硼胁迫处理组中共筛选到50个差异物质,主要涉及碳水化合物代谢和氨基酸代谢;从种子中共筛选到13个差异物质,主要参与了氨基酸代谢。在高硼胁迫下从敖汉苜蓿小花中共筛选到97个差异物质,主要参与氨基酸代谢、碳水化合物代谢、脂质代谢、嘌呤代谢和嘧啶代谢;从种子中共筛选并定性到16个差异物质,主要参与氨基酸代谢。5.综合以上分析发现,在硼胁迫下紫花苜蓿小花与种子主要通过调控氨基酸代谢、碳水化合物代谢、脂质代谢和三羧酸循环等代谢途径来适应硼胁迫,从而适应硼营养缺乏或过量环境。