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巨大革耳、青头菌和铜绿菌阿魏酸酯酶的分离纯化及其理化性质研究

王丽  
【摘要】:阿魏酸酯酶是一种羧酸酯水解酶,它可以水解植物细胞壁中半纤维素与木质素之间或者半纤维素之间通过阿魏酸相连形成的酯键,降解植物细胞壁的同时,将阿魏酸游离出来,因此在食品、化妆品、医药、饲料、造纸工业以及生产生物乙醇中有着广泛的应用前景。本研究以巨大革耳、青头菌和铜绿菌的子实体为材料,通过 DEAE-cellulose,CM-cellulose,Q-Sepharose、SP-Sepharose等离子交换层析、凝胶过滤层析等方法,分离纯化得到3个阿魏酸酯酶,并对其理化性质进行了研究。巨大革耳阿魏酸酯酶为分子量61 kDa的单亚基蛋白。巨大革耳阿魏酸酯酶的最适pH值为4.0,最适反应温度为40℃,且在20-40℃有较高的稳定性。以阿魏酸甲酯(MFA)为底物,在30℃,pH4.0的条件下该酶的Km和Vmax分别为0.36mM和18.98mM·min-1.mg-1。该酶对金属离子比较敏感,供试金属离子对其都具有不同程度的抑制作用。该酶对三种羟基肉桂酸甲酯类底物的催化活性由高到低为:阿魏酸甲酯咖啡酸甲酯p-香豆酸甲酯。巨大革耳阿魏酸酯酶单独作用时可以从去淀粉麦麸和玉米麸中释放出阿魏酸,但释放的量较少,当与木聚糖酶协同作用时从去淀粉麦麸和玉米麸中释放的阿魏酸量分别提高6.4和2.9倍。青头菌阿魏酸酯酶为分子量62 kDa的单亚基蛋白。对其进行质谱测定发现其中有两个肽段GSEFAPRILTDNGLR 和 QGSLLDFEGK,与 Laaccaria bicolor 羧酸酯酶家族 9 蛋白有 100%的同源性。青头菌阿魏酸酯酶最适反应pH值为5.0,最适反应温度为50 ℃,且在20-60 ℃有较高的稳定性。以阿魏酸甲酯为底物,在50 ℃,pH 5.0时青头菌阿魏酸酯酶的Km和Vmax分别为0.19 mM和1.65mM·min-1。Fe2+,Hg2+和Pb2+对青头菌阿魏酸酯酶具有较强的抑制作用,其他金属离子影响相对较小。青头菌阿魏酸酯酶对三种羟基肉桂酸甲酯类底物的催化活性由高到低为:阿魏酸甲酯咖啡酸甲酯p-香豆酸甲酯。青头菌阿魏酸酯酶可以从去淀粉麦麸中释放出阿魏酸,当与木聚糖酶协同作用时释放的阿魏酸量是其单独作用时的5倍多。青头菌阿魏酸酯酶对去淀粉玉米麸没有水解活性,单独作用或与木聚糖酶协同作用时都不能从中释放出阿魏酸。铜绿菌阿魏酸酯酶为分子量55 kDa的单亚基蛋白。对其进行质谱测定发现其中有三个肽段KDAILWDGLPPLDGNK, GKESDEWRR 和 NLMQSQDAYCAK,与 Laccaria bicolor 羧酸酯酶家族9蛋白都有100%的同源性。铜绿菌阿魏酸酯酶最适反应pH值为4.0,最适反应温度为30 ℃,属于偏低温的的酸性阿魏酸酯酶。以阿魏酸甲酯为底物,在30 ℃,pH 4.0时铜绿菌阿魏酸酯酶的Km和Vmax分别为0.32mM和3.77mM · min-1 · mg-1。Hg2+和Fe2+对铜绿菌阿魏酸酯酶的抑制作用较强,其他金属离子影响相对较小。铜绿菌阿魏酸酯酶对三种羟基肉桂酸甲酯类底物的催化活性由高到低为:咖啡酸甲酯P-香豆酸甲酯阿魏酸甲酯。铜绿菌阿魏酸酯酶可以水解去淀粉麦麸和玉米麸产生阿魏酸,当阿魏酸酯酶加入量为160 μU/mg (底物)时,可以从100mg去淀粉麦麸和玉米麸中分别释放出464.9 μg和1097.7 μg的阿魏酸。当与木聚糖酶协同作用时可以从100 mg去淀粉麦麸中释放出759.4μg的阿魏酸,占去淀粉麦麸中阿魏酸总含量的89.3%。


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