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拟南芥外切体组分RRP42的功能分析

闫晓园  
【摘要】:外切体是一个进化上保守的大分子复合物,可以在3'-5'方向上加工和降解RNA,它在RNA代谢中有至关重要的作用。外切体的显著特征是六个含有PH-domain的核糖核酸酶蛋白形成三个不同的异源二聚体:RRP41-RRP45, MTR3-RRP42和RRP43-RRP46,进一步组装成为六聚环,这些二聚体由三个含有S1-domain和KH-domain的蛋白(RRP40,RRP4和CSL4)连接在一起,从而形成一个稳定的九亚基组成的环状结构复合物。在酵母和哺乳动物中,有关外切体的结构及功能方面有较深入的研究,但是在植物中有关外切体的研究较少。本文中我们主要对拟南芥外切体核心亚基RRP42的功能进行了研究与分析,也对RRP46进行了初步的分析。首先,我们通过CRISPR/Cas9技术使RRP42发生突变,经鉴定,获得三个独立的rrp42/RRP42杂合体株系,各株系的突变方式不同,并且均表现出雌配子体发育停止在FG2时期的表型,这些结果表明RRP42在拟南芥雌配子体发育过程中有至关重要作用,缺失RRP42会导致雌配子体致死。为了进一步研究RRP42在生长发育阶段的功能,我们利用Artificial microRNA技术设计了三个作用于RRP42的不同的amiRNAs,获得了若干rrp42knock-down突变体,这些突变体在植株生长发育阶段表现出不同程度的相似的缺陷,主要表现:幼苗阶段子叶发皱,且较小,在生长的后期阶段,叶片锯齿增多,叶片发皱,呈花斑状的发黄,茎生叶最为明显。rrp42 knock-down突变体茎生叶内部解剖结构显示栅栏组织细胞形状异常,叶肉细胞减少。我们在多个rrp42 knock-down突变体的独立株系中检测了RRP4 的表达量,结果显示RRP42的表达量与其缺陷严重程度是一致的,这就表明rrp42 knock-down突变体呈现出的生长缺陷是由RRP42活性降低引起的。组织表达模式结果显示RRP42在胚珠及后期的叶片中表达量较高。这些结果表明RRP42在雌配子体的发育以及叶片的形态建成中有重要作用。根据rrp42 knock-down突变体的表型,我们利用qPCR检测了编码光合作用、细胞壁组装、细胞分裂以及叶片形态建成相关蛋白的mRNA积累情况。结果发现,在6周的rrp42knock-down突变体莲座叶中,编码木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶(xyloglucan endotransglucosylase/hydrolases,XTH)和细胞膨胀素(expansion, EXPA)家族部分成员的mRNA发生大量积累。通过mRNA降解动力学分析发现,在rrp42 knock-down突变体中XTH19,EX A10及EXPA11的降解速度显著慢于野生型,亚细胞定位显示RRP42在细胞核和细胞质中都有表达,这些结果表明RRP42可以作用于细胞质mRNA的降解。此外,我们把RRP42的靶mRNA与外切体其他亚基靶mRNA进行初步比较,结果发现,RRP42靶mRNA的表达量在外切体其他亚基突变体rrp41iRNAi、rrp4iRNAi及rrp411中无明显变化,并且我们也检测了rrp41iRNAi、rrp4iRNAi及rrp41l突变体的部分靶mRNA在rrp42 knock-down突变体中的表达情况,结果显示这些mRNA的积累情况跟野生型基本一致。这些结果表明,外切体亚基在作用于细胞质mRNA的降解中似乎有其特异性。此外,我们还通过CRISPR/Cas9技术获得若干突变方式不同的rrp46/RRP46的杂合体,他们均呈现出胚胎致死的表型,对其功能的分析需要在以后的工作中有更多的研究。


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