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减毒活疫苗及神经毒性药物评价体外替代方法的应用

屈哲  
【摘要】:神经毒性是许多药物、新药先导化合物、环境化合物、农药等常见的毒副作用,需要在药物早期筛选和临床前安全性评价中进行评估。传统的神经毒性评价采用体内动物实验,其缺点是需要使用大量的实验动物,实验周期长、费用高且结果判断主观性强。随着近年来各种体外细胞培养技术的发展,可以实现从细胞结构和功能改变的多参数终点筛选和评价药物或化合物引起的神经毒性,其优势在于可实现高通量高内涵筛选,并从作用机制上解释和评价药物的神经毒性作用。然而,单一的体外替代方法和检测终点不能涵盖所有的神经毒性靶点,因此需要建立针对各类药物或化合物的神经毒性评价方法。基于上述,本研究首次体外培养大鼠原代神经细胞评价减毒活疫苗的神经毒力。首次体外培养大鼠神经干细胞及其分化细胞用于筛选药物的神经毒性。减毒活疫苗体外神经毒力评价的实验方法:选用1-3日龄新生SD大鼠,体外无菌条件下获取大脑实质,培养稳定的原代神经细胞混合培养体系,Anti-MAP2多克隆抗体鉴定神经元、Anti-GFAP单克隆抗体鉴定神经胶质细胞。评价麻疹减毒活疫苗、腮腺炎减毒活疫苗和吸附无细胞百白破火活脊髓灰质炎和b型流感嗜血杆菌联合疫苗(以下简称联合疫苗)对神经细胞的神经毒力作用,评价终点包括CCK8细胞增殖毒性、细胞形态学改变、神经细胞免疫相关因子TNFα、IL-1β、IL-6浓度变化。结果:麻疹疫苗和腮腺炎疫苗均未见显著的CCK8细胞毒性、细胞形态学改变和细胞因子的改变,联合疫苗可见显著的CCK8细胞毒性,细胞胞体变形、核浆比增大,以及TNFα、IL-1β细胞因子的显著升高。体外评价结果与猴体神经毒力的组织病理学评价结果和疫苗的不良反应报道相一致。。大鼠神经干细胞及分化细胞用于评价药物的神经毒性,实验方法:获取孕14天左右SD大鼠胎鼠脑组织于SD大鼠神经干细胞完全培养基中培养形成神经球,经传代后得到稳定的第二代神经球。高通量高内涵评价11种具有神经毒性和发育神经毒性的药物或化合物对神经球生长的毒性作用、神经干细胞EdU增殖毒性、神经干细胞分化神经元的神经突生长毒性以及影响神经干细胞分化为神经元和星形胶质细胞毒性。结果:顺铂、氧化铁纳米粒子、丙戊酸钠、苯妥英钠和乙醇可引起神经球生长抑制;长春新碱、丙泊酚、丙烯酰胺和氧化铁纳米粒子可引起神经球解离细胞破碎;9-顺式视黄酸和瑞芬太尼无神经球毒性作用。长春新碱、顺铂、瑞芬太尼、氧化铁纳米粒子、丙泊酚、丙戊酸钠、苯妥英钠、丙烯酰胺、乙醇均显示EdU神经干细胞增殖毒性作用。顺铂、氧化铁纳米粒子、丙泊酚、丙烯酰胺和9-顺式视黄酸表现为促进神经突生长;瑞芬太尼和苯妥英钠具有抑制神经突生长趋势。顺铂、瑞芬太尼、氧化铁纳米粒子、丙泊酚、丙戊酸钠、苯妥英钠、丙烯酰胺、乙醇可影响神经干细胞的定向分化,其中瑞芬太尼主要影响星形胶质细胞的分化,乙醇对星形胶质细胞和神经元的分化均有影响,其余主要表现为神经元分化毒性;9-顺式视黄酸无神经干细胞分化毒性作用。结论:本课题是在药物非临床安全性评价阶段开展的体外替代方法研究,首次应用大鼠原代神经细胞评价了减毒活疫苗以及多种抗肿瘤药物、麻醉剂等,设定多种检测终点综合评价其产生的神经毒力和神经毒性作用。以期为国内外药物审评机构推进神经毒性体外替代实验的标准化和法规化提供数据,为我国新药神经毒性临床前安全性评价新方法和新技术的建立提供支持。


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