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精氨酸对肉仔鸡肠道黏膜损伤的缓解作用及机理研究

张贝贝  
【摘要】:本研究通过六个试验研究了日粮添加精氨酸对肠道致病菌感染的肉仔鸡肠道黏膜损伤的影响及机理。试验一旨在研究肉仔鸡空肠物理屏障相关基因表达的发育性变化。试验于肉仔鸡第1、7、14、21、28和35日龄采集空肠组织检测紧密连接和粘附连接蛋白的mRNA表达量。结果显示:1日龄时claudin-1表达显著高于其余日龄,而其他日龄之间无显著差异。Claudin-2表达在前14天逐渐增加,14-21日龄急剧下降,21-35日龄为平台期。Claudin-3表达在1-7日龄为平台期,7-21日龄逐渐升高,21-35日龄逐渐下降。Claudin-5在前21天逐渐增加,21-28日龄逐渐下降,28-35日龄为平台期。Occludin和ZO-1的发育模式相似,在1-14日龄逐渐增加,14-35日龄为平台期。ZO-2在前28天逐渐增加,28-35日龄逐渐下降。ZO-3和E-cadherin的发育模式相似,前21天逐渐增加,后 14 天逐渐降低。此外,Claudin-3、claudin-5、occludin、ZO-1、ZO-2、ZO-3 和 E-cadherin表达随日龄呈现极显著的二次曲线效应,且两两之间皆具有极显著的正相关关系。上述结果表明,1-14日龄是物理屏障相关基因(除claudin-1和claudin-3)表达的上升期,而28-35日龄是平台期(除claudin-3和ZO-2)。物理屏障相关基因表达的相关性可能由于它们结构上的相互作用。试验二旨在探究精氨酸水平与饲喂时间对患坏死性肠炎肉仔鸡的肠道免疫和屏障功能的影响。采用3×2因子随机试验设计,包括3种日粮处理:全期饲喂基础日粮(含精氨酸1.25%);全期饲喂含精氨酸1.87%日粮;前期(1-8日龄)饲喂基础日粮,后期(9-28日龄)饲喂含精氨酸1.87%日粮。2种攻毒处理为:不感染;或在第10日龄感染球虫,并在14-20日龄感染产气荚膜梭菌。于21和28日龄采样。结果显示攻毒导致肠道损伤,表现为降低血浆D-木糖浓度、提高回肠通透性、促进盲肠食糜中大肠杆菌和产气荚膜梭菌数量;精氨酸添加可缓解上述现象。攻毒降低28日龄空肠sIgA含量,而精氨酸促进其分泌。攻毒显著降低肠道claudin-1和occludinmRNA表达,而精氨酸可抑制这种现象。攻毒上调肠道中claudin-2、IFN-γ、TLR-2和NOD1 mRNA表达量,而精氨酸促进IFN-γ、IL-10和NOD1 mRNA表达量。上述结果表明,精氨酸可以通过促进固有免疫反应和维护肠道屏障功能缓解坏死性肠炎造成的肉仔鸡肠道黏膜损伤,降低产气荚膜梭菌定植。试验全期饲喂含精氨酸1.87%的日粮效果较佳。试验三旨在研究精氨酸对产气荚膜梭菌感染的肉仔鸡肠道炎症反应的影响及机制。采用2×2因子随机试验设计,包含2种日粮精氨酸浓度(1.42%和1.72%)和2个攻毒状态(不感染或14-20日龄感染产气荚膜梭菌),于21日龄和28日龄采集样品。结果显示产气荚膜梭菌感染显著升高血清降钙素原和尿素氮浓度。精氨酸添加显著降低血清二胺氧化酶、髓过氧化物酶活力和一氧化氮浓度。精氨酸添加缓解了感染引起的血清精氨酸和鸟氨酸浓度的下降,并缓解了感染引起的肠道损伤评分、空肠组织形态损伤、空肠粘膜溶菌酶酶活和iNOS酶活的提高。感染使空肠促炎细胞因子(IL-6、IFN-γ、IL-1β)和抗炎细胞因子(TGF-β)mRNA表达量升高,而精氨酸添加则降低这些细胞因子的表达。感染促进21日龄空肠抗菌肽Cathelicidins(CATH)1和CATH3mRNA表达,而降低28日龄空肠禽β防御素(AvBD)1、AvBD2、CATH3和肝脏表达抗菌肽(LEAP)2mRNA表达量。精氨酸添加降低21日龄AvBD1、AvBD2、CATH1和CATH3mRNA表达量。感染升高空肠碱性氨基酸转运载体(CAT)-1、CAT-2和CAT-3 mRNA表达量,并升高精氨酸分解酶——诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶2(ARG2)、精氨酸脱羧酶(ADC)和精氨酸:甘氨酸脒基转移酶(AGAT)的mRNA表达量;而添加精氨酸显著降低上述3种碱性氨基酸转运载体和4种精氨酸酶的过量表达。精氨酸添加显著减低感染诱导的空肠Janus激酶(JAK)1、JAK2、JAK3、信号转导子和转录激活子(STAT)1和STAT6mRNA的高表达。上述结果表明,日粮精氨酸能预防产气荚膜梭菌感染诱导的肉仔鸡循环精氨酸缺乏,使精氨酸转运和代谢恢复正常,下调激活的JAK-STAT信号通路,从而缓解炎症反应和肠道黏膜损伤。试验四旨在研究精氨酸添加对产气荚膜梭菌感染肉鸡肠道微生物区系组成和功能的影响。试验采用单因素完全随机设计,分为3个处理:对照组、产气荚膜梭菌感染组、饲喂精氨酸添加日粮的产气荚膜梭菌感染组。在14-20日龄进行产气荚膜梭菌攻毒,21日龄采集回肠食糜。结果显示3个处理的微生物区系明显不同,但对照组与精氨酸添加组的微生物结构较为相似。精氨酸能显著缓解产气荚膜梭菌感染引起的厚壁菌门丰度的下降,并显著缓解变形菌门等7种菌门丰度的升高。属水平T-test分析显示,感染引起24个属的相对丰度显著升高,且其中15个属属于变形菌门,精氨酸添加能显著抑制其中23个属。饲喂精氨酸的感染肉鸡与健康肉鸡仅有3个属的丰度显著不同。LEfSe分析显示产气荚膜梭菌攻毒组富含多种变形菌纲,而对照组富含瘤胃球菌科和格氏乳杆菌,感染情况下精氨酸添加组富含梭菌目和乳杆菌目。PICRUST(基于16S rRNA扩增子测序结果预测微生物群落功能)分析显示精氨酸可显著缓解感染引起的大多数微生物基因通路的变化,其中感染引起的代谢、人类疾病和细胞进程基因丰度的上调可被精氨酸显著抑制,感染引起的遗传信息处理和环境信息处理基因丰度的下调可被精氨酸显著促进。以上结果表明,日粮添加精氨酸可提高梭菌目和乳杆菌目等潜在有益菌的数量,减少变形菌门下的有害菌生长,抑制产气荚膜梭菌感染引起的肠道微生物代谢和人类疾病等基因丰度的增加,将感染肉仔鸡的肠道微生物菌群组成和功能调整到与健康肉仔鸡相似。试验五旨在研究精氨酸对鼠伤寒沙门氏菌感染肉仔鸡引起的肠道损伤的缓解作用。采用2×2因子随机试验设计,包含2种日粮精氨酸浓度(1.42%和1.72%)和2个攻毒状态(不感染和8-10、13-16日龄感染鼠伤寒沙门氏菌)。在17和23日龄采集样品。结果显示精氨酸添加降低感染引起的血清二胺氧化酶活力和降钙素原含量的升高。感染降低血清精氨酸浓度,补充精氨酸缓解这一现象。在感染条件下,添加精氨酸提高17日龄血清鸟氨酸和尿素氮含量。精氨酸添加缓解感染造成的肠道形态学损伤。在17日龄,感染提高空肠IL-17mRNA表达量,降低NF-κB、IFN-γ和IL-10 mRNA表达量。精氨酸添加提高空肠IFN-y并降低IL-22 mRNA表达量。在23日龄,感染提高空肠IL-1β、IL-10、IL-17、IL-8和IL-22mRNA表达,精氨酸添加提高空肠IFN-γ和IL-10 mRNA表达量并降低IL-22 mRNA表达量。感染降低17日龄空肠多种抗菌肽mRNA表达量和23日龄空肠LEAP2mRNA表达量,升高23日龄空肠三叶因子(TFF)2mRNA表达量。精氨酸添加升高17日龄空肠TFF2 mRNA表达量,降低23日龄空肠多种抗菌肽表达量但升高LEAP2 mRNA表达量。感染提高空肠CAT-1、CAT-2、CAT-3mRNA表达量,精氨酸添加继续促进三者表达增加。感染显著降低17日龄空肠ARG2 mRNA表达量,提高23日龄空肠ADC和AGAT mRNA表达量,精氨酸添加继续促进23日龄ADCmRNA表达量。以上结果表明,沙门氏菌感染造成循环精氨酸缺乏,促进精氨酸转运,诱导炎症反应。精氨酸添加维护肠道形态,缓解沙门氏菌感染的不利影响,促进精氨酸转运载体表达并调节细胞因子和抗菌肽表达,尤其是促进IFN-y产生,有利于细胞内沙门氏菌的清除。本试验与试验三的结果比较可知,产气荚膜梭菌感染和沙门氏菌感染都可引起机体循环精氨酸缺乏,诱发全身炎症反应和肠道损伤,促进肠道碱性氨基酸转运载体表达。日粮补充精氨酸都可增加机体循环精氨酸浓度,缓解肠道损伤。但两种疾病模型的病理过程不同:产气荚膜梭菌在感染前期即可诱发肠道炎症反应,感染后期肠道炎症反应减弱;而沙门氏菌在感染前期使IFN-γ、NF-κB和大量抗菌肽表达下降,可能有助于沙门氏菌逃避机体免疫系统清除,感染后期诱发肠道炎症反应。精氨酸的调节机制也有所不同:在产气荚膜梭菌感染中,精氨酸缓解了精氨酸分解酶、促炎细胞因子、抗炎细胞因子和抗菌肽等的过度表达,这种调节作用是一致的,可能与提高循环精氨酸浓度进而反馈抑制肠道精氨酸过度转运有关;而在沙门氏菌感染中,精氨酸对不同分子的调节作用不同,精氨酸发挥保护作用可能与促进IFN-γ、增强T细胞数量和功能有关,具体机制有待进一步研究。试验六旨在研究精氨酸对产气荚膜梭菌感染的鸡胚肠上皮细胞炎症反应的影响。结果显示产气荚膜梭菌感染对细胞毒性、IL-1β、IL-6、IL-8和iNOS mRNA表达量的提高具有具有剂量和时间依赖性。适于构建感染模型的剂量和时间分别是感染复数为1,处理4h。50和/或400μM精氨酸可显著抑制产气荚膜梭菌感染引起的细胞毒性、碱性氨基酸转运载体(CAT-1和CAT-3)、iNOS和炎性细胞因子(IL-1β、IL8和IL10)的基因表达量的升高,继续升高感染刺激的IFN-γ和ARG2 mRNA表达。400μM比50μM精氨酸更利于缓解炎症。以上结果表明,精氨酸可通过缓解产气荚膜梭菌感染诱导的CATs、iNOS及炎性细胞因子的增加来减少鸡胚肠上皮细胞的死亡,与试验三动物试验结果基本一致。以上研究表明,日粮精氨酸可通过增加机体循环精氨酸浓度,影响肠道精氨酸转运和代谢,调节肠道免疫反应和抗菌肽表达,改善肠道机械屏障功能,调节肠道微生物菌群组成和功能,缓解肠道致病菌造成的肉仔鸡肠道黏膜损伤。精氨酸添加日粮在全期饲喂的效果优于仅在感染期饲喂的效果。


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