CYP6BG1和UGT33AA4介导的小菜蛾对氯虫苯甲酰胺抗性的分子机制

【摘要】：小菜蛾(Plutella xylostella)是世界范围内十字花科作物的重要害虫,也是抗药性最严重的害虫之一。氯虫苯甲酰胺是一种以鱼尼丁受体(RyR)为靶标的具有全新作用机制的双酰胺类杀虫剂,对鳞翅目害虫高效。但在使用2-3年后,小菜蛾即对其产生了高水平抗性。已经明确RyR突变是导致其产生抗性的主要机制,但对解毒酶介导的代谢抗性机制缺乏深入研究。本文主要研究细胞色素P450单加氧酶和尿苷二磷酸-糖基转移酶(UGTs)在小菜蛾对氯虫苯甲酰胺抗性中的作用,并从表观遗传学角度研究miRNA调控RyR过表达与氯虫苯甲酰胺抗性的关系。主要结果如下:对室内敏感种群CHS、室内筛选抗性种群CHR和云南通海田间种群TH小菜蛾羧酸酯酶、细胞色素P450单加氧酶和谷胱甘肽S-转移酶的比活力测定发现,只有P450的比活力在CHR和TH中均显著高于CHS,分别是CHS的2.1和3.2倍。检测了 10个P450基因mRNA的相对表达量,其中CYP6BG1在5个抗性种群中均过量表达,在TH种群的相对表达量是CHS的82倍。用RNAi沉默CYP6BG1后,P450的7-乙氧基香豆素O-脱乙基活性降低45.5%;用LC50浓度的药剂处理干扰组小菜蛾,其死亡率比对照增加26.4%。在sf9细胞系中表达CYP6BG1蛋白,可显著降低氯虫苯甲酰胺对细胞的毒性和对小菜蛾幼虫的毒力。过量表达CYP6BG1的转基因黑腹果蝇品系对氯虫苯甲酰胺的敏感性显著降低,表明CYP6BG1的过表达与小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性相关。为探索CYP6BG1的表达调控机制,用染色体步移法获得了其DNA 5'上游约1300 bp的侧翼序列。构建7个不同长度片段的瞬时表达载体并分别检测其启动子活性,只有p(-152/+49)、p(-340/+49)和p(-562/+49)的相对活性显著高于对照pGL4。经预测发现上游-340到-562区域存在转录因子FTZ-F1的结合位点。且抗性种群中FTZ-F1的表达量显著高于敏感种群。RNAi沉默FTZ-F1后,CYP6BG1的表达量也显著降低,表明转录因子FTZ-F1可调控CYP6BG1的表达。使用UGTs的抑制剂5-硝基尿嘧啶和磺吡酮可显著增加氯虫苯甲酰胺对小菜蛾幼虫的毒力。检测21个UGTs基因mRNA表达水平表明,在4个抗性种群中UGT33AA4的表达量均显著高于敏感种群(30.7-77.4倍)。RNAi抑制UGT33AA4表达后,抗性和敏感小菜蛾幼虫对氯虫苯甲酰胺的死亡率分别增加27.3%和29.8%,证明UGT33AA4的过表达与小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性相关。前期研究发现PxRyR表达量上调与小菜蛾对氯虫苯甲酰胺抗性相关,进一步从miRNA角度研究了其表达调控机制。软件预测发现在其3'-UTR有miR-7a和miR-8519的结合位点,通过双萤光素酶实验证实这两个miRNA都可与其3'-UTR结合。在三龄幼虫分别过量表达miR-7a和miR-8519均可抑制PxRyR的表达,同时增加其对氯虫苯甲酰胺的敏感性;相反,抑制miR-7a和miR-8519的表达则使PxRyR的表达量增加,降低小菜蛾对该药剂的敏感度。即miR-7a和miR-8519通过调控PxRyR的表达参与了小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性。上述研究结果对于深入揭示小菜蛾等鳞翅目害虫对双酰胺类杀虫剂抗性的分子机制及指导田间合理用药具有重要的理论和实践意义。