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奶牛乳房炎性金葡菌毒力基因和耐药性及其与SCVs致病力差异

张立梅  
【摘要】:奶牛乳房炎是奶牛常见的一种疾病,在世界范围内给奶牛养殖业带来了巨大的经济损失。金黄色葡萄球菌作为一种重要的人类致病菌,也是引起奶牛乳房炎的主要病原之一,目前尚无有效的疫苗预防,抗生素仍然是治疗该病的重要手段。掌握金黄色葡萄球菌的毒力因子模式特征和耐药特性对防控该菌具有重要的意义。近年来,金黄色葡萄球菌小菌落突变株(SCV)在人类临床感染、食品微生物和动物疾病中的报道屡见不鲜,常与复发性慢性感染相关。然而,其与母株致病差异机制尚无报道。因此,本研究旨在对我国牛场临床型奶牛乳房炎中分离的金黄色葡萄球菌进行毒力因子、基因分型、耐药表型进行分析,并研究其与金葡菌小菌落突变株对奶牛乳腺上皮细胞感染的致病差异机制。本研究从全国9个省市的19个牧场中采集1021份奶牛临床型乳房炎奶样,经病原菌分离鉴定获得103株金黄色葡萄球菌。通过常规PCR方法对17个毒力基因进行检测,确定毒力基因模式;根据α-溶血素基因序列的差异对其分型;同时,采用SPA和MLST方法对菌株分型,研究三者之间的相关性。结果发现,17个毒力因子的检出率各不相同,从2%~100%不等,形成38种不同的毒力基因模式,且与MLST分型高度相关;hla基因呈现高度多样性(可分为14个基因型),但其氨基酸序列较为保守;共得到7个MLST分型和24个SPA分型,其中ST97为最主要的基因型;进化树分析显示hla基因的进化与MLST分型一致。此外,采用微量肉汤稀释法和常规PCR方法对103株金黄色葡萄球菌的耐药表型和基因型进行检测,并分析二者之间的相关性;还使用指标聚类法分析了耐药基因和整合子int1存在情况的相关性。结果表明,金黄色葡萄球菌对11种抗生素的耐药率为1.9%~85.5%不等,15种耐药基因的阳性率为1%~82.5%不等。聚类分析结果显示氨苄西林、红霉素、青霉素耐药表型高度相关,三者可能由intI1介导。生存分析显示ermC基因与红霉素耐药相关。最后,利用1株金黄色葡萄球菌及其小菌落突变株(SCVs)为研究对象,检测二者对奶牛乳腺上皮细胞的黏附侵袭率、胞内存活率、细胞毒性、诱导细胞凋亡情况和免疫因子mRNA水平,对其致病力差异进行分析,并利用高通量测序技术对不同处理组的金黄色葡萄球菌和小菌落突变株进行测序和分析。结果表明,与金黄色葡萄球菌母株相比,小菌落突变株SCVs黏附侵袭能力更强;胞内存活时间更长;细胞毒性明显减弱;不能引起显著的细胞凋亡;胞内感染引起更低水平的先天性免疫因子mRNA水平。转录组测序表明,自然状态的SCV菌与SA相比,生物合成代谢相关基因显著下调;发生黏附侵袭的SA菌也表现为与合成代谢相关基因显著下调。。综上所述,hla基因进化与MLST分型一致,可作为金黄色葡萄球菌分型的潜在分子标记;金黄色葡萄球菌多重耐药的现象严重,对红霉素、青霉素和氨苄西林严重耐药。小菌落突变株可通过增强黏附侵袭力、抑制细胞凋亡、减弱免疫反应,增强耐药性等方式实现胞内存活。转录组测序研究丰富了金葡菌小菌落突变株的转录组信息,为进一步开展相关基因的研究及其分子调控机制奠定了基础。


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