拟南芥HIR基因的功能分析和atnop10突变体的鉴定

【摘要】：显花植物的雄配子体,也叫花粉,产生于雄蕊花药中。成熟的花粉粒是一个由一个营养细胞包含两个精细胞组成的三细胞单元。雌配子体,也叫胚囊,形成于雌蕊的胚珠中。成熟的拟南芥胚囊是由一个中央细胞、一个卵细胞和两个助细胞组成的四细胞单元。开花时,花粉落到雌蕊的柱头上,经过相互识别,花粉吸水萌发长出花粉管,花粉管在雌蕊中进行极性生长,最终进入胚囊内部,释放出精细胞,完成双受精。植物雌雄配子体的形成和授粉受精是植物有性生殖的重要环节,与农业生产密切相关,因此研究雌雄配子体的形成、花粉管生长和授粉受精的分子调控机制对了解植物有性生殖的遗传机制具有重要意义,也可为作物遗传育种和农业生产提供理论参考。我们研究组前期的研究工作分析鉴定了拟南芥转录因子基因AtTFIIB1在花粉管生长和胚乳发育中起重要作用。本研究利用attfib1-2突变体作为材料分析鉴定与花粉管生长发育相关的基因。基因芯片数据分析显示,在attfib1-2的花粉中,1048个基因下调2倍以上,2139个基因上调2倍以上,并利用Real-timePCR方法对受影响的基因表达水平进行验证。根据其预测的功能进行分类,鉴定出来自5个家族的基因,在花粉中有较高的表达,推测其可能与花粉管生长发育相关,并选择HIR家族蛋白基因作进一步的分析研究。拟南芥HIR蛋白家族主要有HIR1-HIR4共4个成员,它们的同源性高,蛋白结构高度相似。启动子活性分析显示,HIR家族基因在花粉中均有表达。蛋白质亚细胞定位分析显示,HIR1与HIR2定位于花粉管质膜上。与野生型相比,hir1杂合体植株的角果短小,结实率降低,其花粉败育;其雌配子体的发育停滞在第一次有丝分裂后,且没有中央液泡形成。然而,在hir1纯合突变体中没有出现这一系列的表型。进一步对hir1/+;hir2/+双突变体进行自交分析,结果显示仅当hir1的基因型为杂合体时,才会影响雌雄配子体的发育。此外,hir1突变体与野生型的正反交实验显示,所有的hir1杂合体型突变体均影响雌雄配子体的发育。全长互补实验证明hir1杂合突变体表型是由hir1基因造成。Y2H和IP实验结果显示,任意两个HIR蛋白间都可以发生互作。此外,通过IP-MS实验筛选到RBSC3B和Lhb1B2可能与HIR1互作;BiFC和LCI实验结果验证HIR1与RBSC3B或Lhb1B2互作。初步的遗传分析结果显示,杂合型rbsc3b突变体植株的花粉败育,胚囊停滞在第一次有丝分裂之前,但其纯合体植株不出现表型,与野生型表型相似,该特点与hir1突变株的情况类似。综上所述,HIR1基因在花粉管中表达;HIR1蛋白定位于花粉管的质膜上;HIR1蛋白可与其它HIR蛋白互作,也能与RBSC3B或Lhb1B2互作;hir1杂合体出现雌雄配子体发育缺陷的表型,而纯合体则没有出现表型,具体机制有待进一步研究。同时,本论文也分析了配子体型突变体atnop10及其突变基因的相关功能。利用Ac/Ds基因陷阱与增强子陷阱技术获得的atnop10-1突变体的角果短小,结实率下降。利用CRISPR/Cas9技术获得的atnop10-2突变体,其表型与atnop10-1突变体的一致,细胞生物学观察表明,atnop10-1突变体的雌配子体发育过程中,极核不能正常融合,表明AtNOP10可能通过影响极核的融合在雌配子体的形成中起重要作用。