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产黄青霉半纤维素酶促进木质纤维素降解的机制研究

杨毅  
【摘要】:酶水解效率低和成本高仍是限制木质纤维素有效利用的主要瓶颈,高效辅助酶的开发及作用机理研究受到国内外研究者的普遍关注。半纤维素是限制纤维素酶对纤维素的可及性及水解效率的重要因素。因此,发掘组成齐全且活性高的半纤维素酶,作为商业纤维素酶的辅助酶,对于提高木质纤维素的整体转化率具有重要意义。以实验室前期研究工作中分离筛选到的高效木质纤维素降解菌株-产黄青霉P33(Penicillium chrysogenum P33)为材料,首先研究了诱导P33产酶的最佳碳源,并对其胞外酶系促进商业纤维素酶制剂的效果和机制进行了研究。结果表明,麦麸和微晶纤维素复合碳源是诱导P33分泌木质纤维素降解酶的最佳碳源。P33胞外酶系对商业纤维素酶的水解能力具有很好的促进作用。在不增加总酶用量的情况下,50%的P33酶系替换商业纤维素酶制剂水解脱木质素玉米秸秆,还原糖的释放量增加78.6%,葡聚糖和木聚糖的转化率分别增加了 37%和106%。该酶系可以促进纤维素酶对多种生物质的水解。采用液相色谱-串联质谱联用技术对P33胞外酶系进行了鉴定,发现P33能够分泌完整且高丰度的半纤维素降解酶类.包括木聚糖酶、β-木糖苷酶、木葡聚糖酶、酯酶和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶等,占总蛋白数量的10.1%,此外.P33还能够分泌丰富的淀粉酶、果胶酶、氧化还原酶以及一些非水解蛋白。P33酶系中丰富的辅助酶类是其能够显著促进商业纤维素酶制剂水解的原因。基于胞外蛋白质组的结果.从P33中首次克隆表达了一个新型的双功能糖苷水解酶rPcAxe,该重组酶同时具有乙酰木聚糖酯酶和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的活性。rPcAxe乙酰木聚糖酯酶的最适pH和温度分别是7.0和40℃,具有较高的pH稳定性,在pH6.0-9.0孵育1 h仍能保持100%的酶活力,具有较高的金属离子抗性。rPcAxe阿拉伯呋喃糖苷酶活性的最适pH和温度分别是7.0和50℃。rPcAxe与来源于裂褶菌的木聚糖酶rScXYL表现出显著的协同作用,最大协同系数为1.35。以20%的rPcAxe替换等量的商业纤维素酶水解脱木质素玉米秸秆,纤维二糖的释放量减少45%,同时葡萄糖的释放量增加了 51%,表明rPcAxe可以促进纤维酶对纤维寡糖的水解。克隆并表达了 P33在麦麸和微晶纤维素诱导培养时分泌的全部三个木聚糖酶Xyl1、Xyl2和Xyl3,其中Xyl1和Xyl3属于GH10家族,且Xyl3的C端还携带有一个碳水化合物结合模块(Carbohydrate-binding module,CBM)CBM1,Xyl2 属于 GH11家族。不同木聚糖酶之间的协同水解实验表明,Xyl2和Xyl3之间存在明显的协同作用,并能显著促进商业纤维素酶的水解。通过TLC分析木聚糖酶水解模式底物的产物发现,三个木聚糖酶之间的协同作用主要是水解模式上的协作,而且首次用实验的方法证明了 GH11木聚糖酶的水解产物能被GH10木聚糖酶进一步水解,反之则不行。Xyl3携带的CBM1在天然底物的水解中发挥着重要作用。为了研究多个CBM对木聚糖酶的影响,从菌群EMSD5中克隆表达了一个同时携带CBM13和CBM2的GH11木聚糖酶46506,同时构建了三个不同截短CBM的木聚糖酶突变体。通过研究对模式底物和天然底物的水解,发现CBM13和CBM2均不影响木聚糖酶的水解特性,CBM2主要参与可溶性底物的水解,而CBM13主要是在天然木质纤维素底物的水解中发挥作用。


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