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沙门氏菌新型效应蛋白揭示细菌自噬通路机制的研究

许悦  
【摘要】:真核细胞通过选择性自噬的方式识别胞内细菌的过程称为细菌自噬。细菌自噬在宿主免疫防御中发挥重要作用。在细菌自噬研究中最核心的问题即宿主细胞是如何感知胞内细菌并启动自噬的。虽然许多课题组对此进行过大量研究并提出很多宿主自噬系统主动识别胞内细菌的假说,但现有的模型均不能解释所有现象。在本论文中,我们从沙门氏菌感染细胞后只能引起少量自噬体形成这一表型出发,首次利用细菌全基因组转座子筛选鉴定出一个可以高效抑制细菌自噬的新型效应蛋白(命名为SebX)。沙门氏菌的sebX缺失突变体可以使宿主通过自噬识别细菌的比例增加到80%,这解释了为什么只有少部分野生型沙门氏菌能够被宿主自噬反应识别。我们进一步发现,SebX可以抑制不同种类细菌触发的自噬过程,但对包括经典自噬在内的其它自噬通路没有影响。SebX对细菌自噬的选择性表明细菌自噬的发生机制与经典自噬通路不同。接下来,为了研究细菌自噬所必需的宿主基因,我们设计并完成了基于流式细胞荧光分选的CRISPR/Cas9全基因组筛选。筛选发现除已知的ATG基因外,V-ATPase复合物也参与在细菌自噬过程中。一系列实验证明只有在细菌感染的条件下,V-ATPase可以与ATG16L1结合,并介导细菌自噬的起始。V-ATPase与ATG16L1的相互作用依赖于ATG16L1的WD40结构域,并且二者的结合可以被SebX破坏。我们还证明SebX可以通过抑制V-ATPase-ATG16L1通路进而促进沙门氏菌在体内的扩散与增殖。通过解析SebX的晶体结构,我们发现SebX具有ADP-核糖基转移酶活性(与霍乱毒素相似,它被真核蛋白ARF家族蛋白激活)。在富集修饰底物并对其进行质谱分析后,我们发现ATP6V0C(V-ATPase复合物的亚基)为SebX的底物蛋白。细菌感染分泌的SebX催化ATP6V0C第124位谷氨酰胺发生ADP-核糖基化修饰,进而抑制细菌自噬的发生。最后,我们证明ATP6V0C第124位氨基酸决定了细菌自噬是否可以发生,但不影响经典自噬途径。本研究从细菌和宿主细胞两方面出发,最终同时指向V-ATPase复合物与ATG16L1的结合决定了细菌自噬的发生这一结论。效应蛋白SebX的发现为了解细菌自噬的识别机制提供了关键的证据。V-ATPase-ATG16Ll介导细菌自噬的发现解答了长期以来关于细菌自噬识别的疑问,为细菌自噬的调控机制提供了新的实验证据。


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