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SOS途径通过膜联蛋白AtANN4介导盐胁迫下钙信号特异性调控机制的研究

马亮  
【摘要】:钙离子(Ca2+)作为植物细胞内重要的第二信使参与众多的生物及非生物胁迫,如病原菌侵染、干旱胁迫、冷/热胁迫、氧化胁迫以及盐胁迫等。环境胁迫造成植物胞质内的钙离子浓度([Ca2+]cyt)迅速上升,并且在时空上发生不同程度的改变,具体表现为Ca2+升高持续时间、强度、振幅、频率等方面的差异。这种不同环境胁迫下特异变化的[Ca2+]eyt被定义为“Ca2+信号”(Calcium signature)。植物细胞通过对Ca2+信号的感知、识别与解码,激活下游的基因转录或相关蛋白/酶活性,以维持环境胁迫下细胞正常的生命活动。但目前对于环境胁迫下Ca2+信号特异产生以及特异性调控机制的研究并不是十分清楚。前期的研究表明植物经典抗盐SOS(Salt Overly Sensitively)途径是一种Ca2+依赖激活的信号转导途径,但是体内的Ca2+依赖激活调控过程需要进一步验证;同时盐胁迫下,对SOS途径中特异Ca2+信号的产生与调控机制的研究尚不完善。本研究首先在体内证实了盐胁迫诱导升高的[Ca2+]cyt参与激活SOS途径,发现SCaBP8和SOS2负调控盐胁迫诱导的[Ca2+]cyt上升,通过酵母双杂交筛选互作蛋白的方法得到可能参与这一过程的调控因子AtANN4。体外/体内互作实验证明SCaBP8与AtANN4在质膜上相互作用,基于Aequorin和YC3.6的Ca2+信号测定和SOS2活性实验表明,AtANN4调控[Ca2+]cyt上升并参与SOS途径激活过程。体外磷酸化实验表明,SOS2可介导AtANN4的磷酸化修饰,主要发生于AtANN4 N端可变区第46位丝氨酸。进一步的磷酸化实验、酵母三杂交以及荧光素酶互补实验分析发现,SCaBP8可介导SOS2与AtANN4相互作用,并增强SOS2对AtANN4的磷酸化修饰。同时,体内免疫共沉淀及酵母双杂交实验发现,磷酸化修饰的AtANN4增强了与SCaBP8之间的相互作用。故盐胁迫能促进形成并稳定SCaBP8-AtANN4-SOS2蛋白复合体。生理学实验以及遗传学表型实验分析发现,AtANN4介导盐胁迫下Ca2+内向转运并参与激活SOS途径。异源HEK293体系中进行膜片钳实验以及ATP介导的Ca2+信号成像实验结果表明,AtANN4具有Ca2+通道/通道共调控因子活性,SCaBP8的相互作用以及SOS2介导的磷酸化修饰作用均能够抑制AtANN4的离子通道/通道共受体活性,因此盐胁迫下稳定的SCaBP8-AtANN4-SOS2蛋白复合体通过调节AtANN4活性最终形成盐胁迫下特异的Ca2+信号。综上所述:本研究发现了 AtANN4是SOS途径中重要的调控因子,参与盐胁迫下Ca2+信号的调控和SOS途径的激活,同时解析了 SOS途径中特异Ca2+信号的产生以及调控机制,即信号通路的下游组分SCaBP8-SOS2可以通过形成负反馈调控环调控AtANN4的活性,最终形成盐胁迫下特异的Ca2+信号,参与植物长期的盐胁迫响应。这些结果丰富了我们对细胞Ca2+信号转导途径的认识,同时也有助于我们了解植物如何平衡环境胁迫和生长发育过程。


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