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microRNA-7敲除小鼠模型的建立及雄性生殖力分析

林皓  
【摘要】:microRNA-7是一种在各物种间序列高度保守的microRNA。已有研究表明,microRNA-7在疾病的发生、器官的发育、癌症的产生等生物活动中发挥着重要的作用,并且在内分泌器官中有较高水平的表达。然而,其在动物生殖发育过程中的作用及机理尚不明确。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了 microRNA-7三种亚型的基因敲除小鼠模型,并对其雄性生殖力进行了分析,为进一步研究microRNA-7在动物生殖发育过程中的作用奠定了基础。首先,利用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测了成年小鼠各组织器官中microRNA-7的表达水平。结果表明microRNA-7在垂体、下丘脑、肾上腺等内分泌组织中具有高水平的表达,并在睾丸、子宫、附睾等生殖器官中具有较高水平的表达。此外,原位杂交检测结果表明,microRNA-7在小鼠睾丸中的支持细胞及各阶段生殖细胞中均有表达。其次,利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术,构建了 microRNA-7a1、microRNA-7a2以及microRNA-7b基因敲除小鼠模型。通过采用目标基因PCR扩增、测序、Real-time PCR的检测方法,对小鼠模型进行鉴定,结果表明microRNA-7三种亚型基因敲除小鼠均为基因序列大片段缺失个体,且缺失位于microRNA-7成熟序列区域。microRNA-7三种亚型基因敲除小鼠的microRNA-7基因表达水平都有极显著的降低。利用T7EI法对基因敲除小鼠潜在脱靶基因进行检测,结果表明三种microRNA-7基因敲除小鼠模型中均不存在脱靶效应。对microRNA-7三种亚型基因敲除小鼠模型的表型分析,发现基因敲除小鼠的出生率和成活率较野生型小鼠相比无明显差异。microRNA-7a2基因敲除成年小鼠的睾丸、附睾、子宫组织的体积与重量较野生型相比有显著性的减小和降低。但microRNA-7a1和microRNA-7b基因敲除成年小鼠各组织器官重量和形态与野生型小鼠相比无明显差异。配种实验结果表明,microRNA-7a2基因的缺失会导致雄性和雌性小鼠的不育,然而microRNA-7a1和microRNA-7b基因敲除小鼠与野生型小鼠相比繁殖力无显著性差异。对microRNA-7a2基因敲除成年小鼠睾丸和附睾组织进行切片染色观察,结果显示,睾丸中部分曲细精管的生精上皮中有空洞产生,附睾组织结构无明显变化,但附睾尾管腔中精子的数量明显减少。对microRNA-7a2基因敲除雄性小鼠精子活力检测发现,其精子数目、精子运动能力都较野生型小鼠相比有显著性的降低。血清中促性腺激素检测表明,雄性microRNA-7a2基因敲除小鼠血清中促卵泡激素(FSH)与黄体生成素(LH)的激素水平均有显著性的下降。最后,为进一步研究microRNA-7a2在雄性小鼠生殖系统中的作用和功能,我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功的构建了 Loxp序列标记的microRNA-7a2的转基因小鼠模型(microRNA-7a2flox/flox),为microRNA-7a2条件性基因敲除小鼠模型的建立奠定了基础。本研究结果表明,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建的microRNA-7三种亚型基因敲除小鼠模型具有高可靠性,可以用于microRNA-7功能及其作用机理的研究。另外,本研究结果表明microRNA-7a2的缺失会造成雄性小鼠不育,生殖系统功能的改变,说明microRNA-7a2在小鼠的生殖发育中发挥着重要的作用。


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