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拟南芥SNARE蛋白VAMP711通过调控质膜H~+-ATPase响应干旱胁迫的机制研究

薛媛  
【摘要】:干旱胁迫是植物生长发育过程中遇到的主要非生物胁迫之一,它严重抑制植物的生长和作物的产量。植物激素脱落酸(Abscisic Acid,ABA)在植物干旱胁迫响应过程中具有非常重要的作用。研究表明,干旱胁迫来临时,植物可以通过ABA信号转导途径抑制质膜H+-ATPase活性,从而促进气孔的关闭以防止体内过多的水分损耗。质膜H+-ATPase持续激活的突变体ost2-2D(H+-ATPase家族成员AHA1基因的突变)具有明显的干旱胁迫敏感表型。表明质膜H+-ATPase活性在响应干旱胁迫方面具有非常重要的作用。但是目前ABA调节质膜H+-ATPase活性的机制还不是很清楚。为了寻找参与ABA通过质膜H+-ATPase促进气孔关闭过程中的调控因子,本研究利用ABA处理的稳定表达AHA1的转基因材料,通过免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)和液相色谱-串联质谱(Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry,LC-MS/MS)的方法筛选到与 AHA 1互作的蛋白 VAMP711(Vesicle-Associated Membrane Protein711)。拟南芥VAMP711 属于 SNARE(Soluble NSF-Attachment Protein Receptor)蛋白家族,在介导囊泡与液泡的融合过程具有重要功能。通过荧光素酶互补成像(Firefly Luciferase Complementation Imaging,LCI)实验发现,VAMP711 与 AHA1 之间的互作受 ABA 诱导。双分子荧光互补(Bimolecular Fluorescence Complementation,BiFC)实验,发现VAMP711与AHA1的互作部分存在于细胞膜上。酵母双杂交(Yeast Two-hybrid)实验表明,AHA1/AHA2的C端887至897之间的11个氨基酸残基对VAMP711与AHA1/AHA2的互作是必需的。拟南芥质膜H+-ATPase活性分析发现,VAMP711基因的缺失会造成质膜H+-ATPase活性的升高;在体外,原核表达的VAMP711蛋白能够直接抑制质膜H+-ATPase活性;酵母系统中,VAMP711能够抑制依赖拟南芥质膜H+-ATPase AHA2活性的酵母在葡萄糖培养基上生长。这些结果表明,植物VAMP711为质膜H+-ATPase的负调控因子。为了进一步探究植物中VAMP711通过质膜H+-ATPase响应干旱胁迫的分子机制,本研究检测了 VAMP711对质膜H+-ATPase在细胞膜上蛋白量的影响。蛋白免疫印迹(Western Blotting,WB)实验结果表明,VAMP711不影响质膜H+-ATPase在细胞膜上的含量。对GFP-VAMP711的亚细胞定位分析发现,在ABA处理下VAMP711向细胞膜靠近;非损伤微测实验(Non-invasive Micro-test Technique,NMT)和质膜H+-ATPase活性实验结果表明,ABA虽然对野生型和vamp711的质膜H+-ATPase活性都有抑制,但是对vamp711的抑制程度低于野生型,表明ABA对质膜H+-ATPase的活性的抑制部分由VAMP711介导。在拟南芥ost2-2D突变体中过表达VAMP711能够部分的抑制ost2-2D的干旱胁迫敏感表型,表明在拟南芥中VAMP711通过抑制质膜H+-ATPase的活性响应干旱胁迫。综上所述,本研究发现拟南芥SNARE蛋白VAMP711参与调节ABA介导的质膜H+-ATPase活性抑制以促进气孔关闭过程。在干旱胁迫下,植物中ABA的积累促进VAMP711与AHA1/AHA2在细胞膜上互作,抑制了质膜H+-ATPase的活性,从而促进气孔关闭,减少植物体内水分的损耗,提高植物的耐旱性。


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