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海栖热袍菌xynB基因的克隆和表达、重组木聚糖酶的提纯及其酶学性质

江正强  
【摘要】: 半纤维素是仅次于纤维素含量第二丰富的可利用自然资源,其主要成分是木 聚糖(xylan)。木聚糖的来源不同,分枝程度不同,其主链和支链带有多种不同 的取代基团。由于木聚糖结构的复杂性,它的完全降解需要多种水解酶的参与共 同作用完成。β-1,4-内切木聚糖酶(EC.3.2.1.8)能够以内切方式作用于木聚糖主 链产生不同长度的木寡糖和少量的木糖,因此是木聚糖降解酶中最关键的酶。 极端嗜热菌海栖热袍菌能够利用木聚糖发酵,具有二个产木聚糖酶的基因 xynA和xynB。本文系统地研究并首次报道了极端嗜热菌海栖热袍菌(Thermotoga. maritima)的第二个产木聚糖酶基因即xynB基因的克隆和在大肠杆菌中的表达、 基因重组酶的提纯及其酶学性质研究。得出的主要结论如下: 1.xynB基因克隆和在大肠杆菌中的表达 以海栖热袍菌MSB8(Thermotoga maritima MSB8)的基因组DNA为模板, 根据xynB基因全序列,设计两对引物,有效地扩增出了xynB基因片段,并进行 拓扑TA克隆和DNA序列测定。选用pET28a(+)表达载体,设计了两种构建 方案,NdeⅠ-Hind Ⅲ酶切位点并编码了氨基端6×His标签的阳性克隆,在表达 过程中在细胞内形成包涵体;NcoⅠ-Hind Ⅲ酶切位点并编码了羧基端6×His标 签的阳性克隆表达成可溶且具有生物活性的蛋白,将确定的单菌落作为基因工程 菌株保存。 测定的xynB结构基因序列由1044对碱基组成,编码347个氨基酸。根据已 知木聚糖酶蛋白质氨基酸的同源性调查,XynB与T.sp.strain FjSS3-B.1的XynA 的同源性最大,为85%,与T.neapolitana的XynB同源性次之,为82%。与其 它木聚糖酶的同源性小于43%。另外,T.maritima MSB8的XynB属于F/10族木 聚糖酶,并且只含有单一功能区。 2.木聚糖酶XynB的提纯 热处理能够简便地初步纯化在常温菌中表达的耐热木聚糖酶。70℃加热10 min处理粗酶液最为理想,可以去掉23%的杂蛋白,同时收率高达91%。 大肠杆菌中表达的木聚糖酶B在羧基端上带有6×His标签蛋白质,用一步 Ni-NTA亲和柱层析可使酶的纯度达90%以上。 通过对粗酶提取液的热变性、Ni-NTA亲和柱层析和离子交换柱层析,得到 了电泳纯的木聚糖酶XynB,提纯倍数44.4,得率11%。SDS-PAGE表明木聚糖 酶XynB的相对分子量为42kDa,与理论推算的分子量(42,333Da)相吻合。 一 3.木聚糖酶XynB的酶学性质 Xy nB的最适出值为6,14左右,在出值5.14~8.20能保持最高活力的 50%以上。该酶表现出很高的pH稳定性,而且在碱性范围内比酸性范围内更稳 定。在50’C时,在实验范围内pH值5~12范围内都很稳定;在70℃时,PH值 5.5~11.5,甚至在100’C时,pH值6.5~8.5范围内也都很稳定。XynB在最适叫 6* 下的最适酶反应温度为90’C,而且具有很高的热稳定性。 在0.ide浓度下不同金属阳离子和EDTA对酶活力的影响表明,多种金属 阳离子和EDTA对酶活力的影响不大。金属阳离子螫合剂EDTA仅能降低6%的 相对酶活力,说明酶反应不需要金属离子的参与。 所用的醇类在合适浓度下都能提高 XynB 从底物 P巾itroPhenyl p-D-xylobioside中释放p-nitronhenvl的能力。其中,在 ZM 异丙醇(iso-ProPanol) 中,相对酶活力提高至最大,达对照的 2*倍。另外,从甲醇至辛醇都能在一定 程度上增加 XyB的水解速率,并且随着碳链长度的增加,Xyns从底物中释放 尸dtrophenyl的相对速率增加。无论30’C或70’C,都是50mM戊醇中entanol) 影响最大,分别提高相对水解速率至2.4和2.5倍。 XynB作用的底物比较广泛,其中对PNP卡-xylobioside的 N值非常小, 仅0刀095to刀006InM,说明酶与该底物的亲和力非常大。对 pNP-pD-xylopyranoside、pNP-p习-cell加ioside、尸卜卜-aI-ar劝inonvranoside和 pNP-p-D-ucopyfanoside的 e值分别为 10.4切.6、3.6切.25、10·Zed·9和 1二.9土1.ZInM。 4.木聚糖酶XynB的转糖昔化活性 不同醇类对 XynB 7R解pNI,卡Al《yl的iOSidC的影响表明:直碳链的一级结构 醇类是最好的受体,二级结构醇类次之,三级结构的醇类最差。另外,根据几c 分析产物的浓度,在四种直碳链的一级结构醇类中,正丙醇门)是转 糖昔化反应最好的受体。 XyB对五种人工合成底物能够同时催化水解和转糖昔化反应,在转糖昔化 反应过程中,添加不同醇类则不同醇类分别作为受体;不添加任何醇类,则水解 产物本身作为转糖昔化反应的受体。 以衅书AI-XylopFanosidO和研乃-D-XylobiOSidS为底物的水解模式表明: XyB催化的反应比较复杂,几乎同时催化水解和转糖昔化反应,原始底物消耗 完之后,继续水解转糖昔化反应产生的产物。


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