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利用Cre/lox重组系统筛选友好基因座

桑璐  
【摘要】: 本实验拟利用Cre/lox系统来筛选出友好基因座,即在动物细胞染色体上找到一个可以高效表达外源基因的“友好座位”,以使外源基因在导入动物体后能够高效表达的整个实验技术过程更有效、更容易。 合成loxP和lox511位点,将其同方向地克隆到载体pEGFP-1的多克隆位点之内,构建成含有lox位点的通用载体——plox,然后将报告基因GFP及neo基因片段克隆到载体plox上的loxP和lox511序列之间,构建成一基因打靶载体—ploxGFP。将鸡γ-干扰素cDNA克隆到载体plox上的loxP和lox511序列之间,构建成另一打靶载体—ploxIFN。首先将质粒ploxGFP DNA电转染牛胎儿成纤维细胞,并用G418筛选,筛选出绿色荧光细胞克隆,增殖培养之后,将质粒ploxIFN和pBS185 DNA共转染荧光细胞克隆,筛选出不发光的克隆。 用PCR法检测两个不发光细胞克隆、发光细胞克隆及共转染后培养一周的细胞,并用质粒ploxIFN、质粒ploxGFP及牛基因组作为对照。引物设计的位置是在loxP和lox511之外的载体序列,整个载体序列都随转染而进入细胞。经PCR检测后,有一个不发光细胞克隆扩增出了与对照质粒ploxIFN相同的约1000bp的条带,表明发生了替换反应;另一个不发光细胞克隆认为是在Cre重组酶的作用下其内部自行发生了剪切作用,剪切了GFP基因,从而只扩增出了载体序列和一个lox位点的约500bp的条带。以绿色荧光细胞克隆为模板扩增出了包括GFP基因、neo基因等在内的约4Kb的条带;以共转染后的未经筛选的细胞为模板既扩增出了约1000bp的条带,又扩增出了约4Kb和500bp的条带。牛基因组没有任何载体序列,因而没有扩出任何条带。 结果表明,Cre/lox系统用于筛选使外源基因能够在动物体内高效表达的友好基因座是可行的。 此外,利用动物乳腺生物反应器在乳腺中高效表达外源基因已经成为转基因动物的研究热点,这是因为它不仅具有理论研究的价值,而且也有很大的实际应用价值。本实验旨在利用牛αS1—酪蛋白的5’调控区和3’侧翼区来构建乳腺特异表达载体。 利用PCR反应,分别扩增出了牛αS1—酪蛋白的5’调控区约2.08Kb和3’侧翼区约2.76Kb。首先将牛αS1—酪蛋白的5’调控区克隆到载体pEGFP-1上,成为载体P-5;然后将牛αS1—酪蛋白的3’侧翼区克隆到载体P-5的GFP基因位置,从而构建成乳腺通用表达载体pbCAS。 最后,我们将鸡γ—干扰素cDNA插入到载体pbCAS的牛αS1—酪蛋白的5’调控区和3’侧翼区之间,构建成载体pbCASIFN,以便于通过生产转基因小鼠来检验牛αS1—酪蛋白的5’调控区和3’侧翼区是否可以调控外源基因鸡γ—干扰素在乳腺中特异表达。


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