番茄多聚半乳糖醛酸酶（PG）反义基因表达及相关功能研究

【摘要】： 多聚半乳糖醛酸酶(PG)广泛作用于果实软化、器官脱落、花粉授粉、种子发育等过程，本文重点探讨了PG与乙烯以及其它植物激素的关系，PG在植物防卫反应中的作用。揭示PG功能的多样性。 采用农杆菌介导法成功地将反义PG基因导入新疆加工番茄(品种代号：98-75)。PCR和Southern杂交分析表明，4株为阳性植株，反义PG基因已整合到这4株加工番茄基因组中。转基因加工番茄的硬度和可溶性固形物含量比对照果实有一定程度的增加；果实饱满有光泽；可溶性果胶含量在同时期低于对照。这4株转基因番茄果实的PG活性分别为对照果实的83％、88％、63％、46％。Northern杂交分析表明，转基因番茄果实的PG、LOX和LeEXP1基因表达水平下降。从酶学、理化性状和分子水平三方面研究结果表明，转反义PG基因加工番茄果实成熟软化进程被延缓。 本文研究了LeEXP1、LOX和PG基因在普通番茄、转反义ACS番茄和Nr突变体番茄果实中的表达模式，结果表明，PG基因表达规律与番茄果实成熟软化进程一致，PG与细胞壁疏松因子LeEXP1和软化启动因子LOX共同调控果实软化。 本课题从乙烯对PG作用的影响和PG对乙烯的反馈调节两方面研究了乙烯与PG之间的关系。首先以普通番茄、转反义ACS番茄和Nr突变体番茄果实以及外源乙烯和1-MCP处理的普通番茄果实为试材，研究乙烯对PG的调控机制，结果表明，在乙烯缺陷型的转反义ACS番茄和乙烯信号转导途径受阻的Nr突变体番茄果实中PG基因表达和PG酶活性都显著低于普通番茄；外源乙烯(100μl／L)处理绿熟期番茄果实明显促进了PG基因的表达；1-MCP(1μl／L)处理转色期番茄果实显著地抑制了PG基因表达，说明PG基因表达受乙烯调控。另一方面，以转反义PG基因番茄和100mg／L D-半乳糖醛酸(D-GA)处理的未熟期普通番茄果实为试材，进一步研究PG对乙烯的作用，结果表明，转反义PG基因番茄果实乙烯释放量降低，乙烯受体基因LeETR4和乙烯信号转导途径中的LeERF2基因表达量下降，D-GA处理促进了乙烯的生成和LeETR4、LeERF2基因的表达，说明PG对于乙烯的合成和反应有一定的反馈调节作用，乙烯与PG之间存在互作关系。 为了探讨植物激素对PG基因表达的调控模式，分别用0.1mM ABA、0.1mM GA、0.1mM IAA、0.1mM 6-BA、1mM SA处理普通番茄、转反义ACS番茄和Nr突变体番茄果实组织圆片，0.1mM ABA和1mM SA处理番茄幼苗。结果表明，在普通番茄果实中，ABA、IAA、6-BA、SA明显促进PG基因表达；GA抑制PG基因表达；在转反义ACS番茄果实中，ABA、IAA和6-BA促进PG基因表达；GA和SA对PG基因表达没有明显影响；在Nr突变体番茄果实中，GA、IAA、6-BA和SA促进了PG基因表达；ABA对PG基因表达没有明显影响。ABA和SA促进了番茄幼苗PG基因的表达。 0.2M NaCl处理绿熟期普通番茄果实组织圆片和幼苗促进了二者PG、LeEXP1、LOX和LeETR4基因的表达，PG基因对NaCl胁迫的应答最迅速，结果表明PG基因作为早期信号基因参与植物胁迫反应。 寡糖激发子chitosan处理番茄果实和幼苗的实验结果表明，PG基因表达受chitosan诱导明显增强，钙离子螯合剂EGTA部分抵消了这种作用，表明Ca~(2+)可能影响激发子诱导PG基因参与的植物防卫反应。