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番茄果实乙烯信号转导组分EREBPs基因克隆和表达研究

蔚变云  
【摘要】: 乙烯对植物的生长发育起重要的调控作用,随着乙烯信号转导研究的不断深入,许多乙烯信号转导组分已被分离和鉴定,并在模式植物拟南芥中已建立乙烯信号传递过程中的核内级联反应:EIN3→ERF1(EREBPs)→病原相关蛋白,但在番茄中还没有建立EIN3→EREBPs→果实成熟相关基因的相似路径。EREBPs(乙烯反应元件结合蛋白)是一个转录因子家族,通过与乙烯调节的目标基因的启动子区结合而调节目标基因的表达。番茄是研究果实成熟的模式植物,对番茄EREBPs基因的研究,将使我们对乙烯调控果实成熟相关基因表达的机制更加明确,进一步丰富和完善乙烯信号转导理论。 本课题根据GenBank中的拟南芥、烟草、番茄EREBPs家族成员的序列比较,在保守区(ERF结构域)设计简并引物(degenerate primer),以破色期普通番茄果实RNA为模板,进行RT-PCR扩增,获得114 bp的同源片段,以此片段为探针筛选破色期普通番茄果实cDNA噬菌体文库,获得两个包含全长编码区的阳性克隆。序列分析表明这两个基因都属于EREBPs家族,依次命名为LeERF1、LeERF2。LeERF1 cDNA为1041 bp,开放阅读框编码204个氨基酸;LeERF2 cDNA为2898 bp,开放阅读框编码210个氨基酸。LeERF1与EREBP4、DDTFR10/A在氨基酸水平上的序列相似性为33%,LeERF2与EREBP3、pti5在氨基酸水平上的序列相似性为46%,是新的基因。LeERF1、LeERF2的核酸序列已在GenBank登录,登录号分别为AY077626、AY275554。 Northern杂交分析表明:LeERF1、LeERF2、pti4(已发表的番茄EREBPs成员)基因在普通番茄果实的成熟过程及果实的不同部位都有差异表达,表现出与成熟进程的相关性。在转反义ACS和Nr番茄果实中,LeERF1、LeERF2、pti4基因表达总体水平上比普通番茄中的低,但仍然表现出与成熟进程的相关性。 乙烯处理(100μl/L)绿熟期普通番茄果实0.5h后,LeERF1、LeERF2基因表达明显增强,pti4基因在乙烯处理后12h表达增强;而用乙烯受体抑制剂1-MCP(1μl/L)处理普通番茄破色期果实10h后,LeERF1、LeERF2、pti4基因表达都受到了抑制,表明LeERF1、LeERF2、pti4基因表达受到乙烯的正调控。 激素和化学试剂处理结果表明:0.1 mM ABA处理绿熟期普通番茄果实8h后,乙烯生成增加,LeERF1、LeERF2基因表达增强;1 mM SA处理绿熟期普通番茄果实8h后,乙烯的生成稍有抑制,LeERF1基因表达受到抑制,LeERF2基因表达与对照基本相近;而ABA和SA处理对pti4基因的表达没有影响,表明果实中pti4基因表达不受ABA和SA的诱导。0.1 mM ABA处理番茄幼苗,随着处理时间的延长,LeERF1、LeERF2、pti4基因表达都逐渐增强;1 mM SA处理番茄幼苗0.5h后,LeERF1、LeERF2,pti4基因表达明显增强,然后随着处理时间的延长逐渐下降,表明ABA和SA对LeERF1、LeERF2、pti4基因表达的诱导具有组织特异性。CaCl_2渗透处理绿熟期番茄整果,随着CaCl_2处理浓度的增加,LeERF1、LeERF2、pti4基因表达逐渐减弱,表明钙可调控乙烯信号转导组分。 构建了正义植物表达载体pGA643-LeERF1、pGA643-LeERF2和反义植物表达载体pBI121-LeERF1、pBI121-LeERF2,并转入农杆菌菌株EHA105。


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