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油葵中绿原酸和咖啡酸的提取及对oxLDL诱导损伤内皮细胞的保护作用

陈少洲  
【摘要】: 绿原酸(Chlorogenic acid,CGA)和咖啡酸(Caffeic acid,CA)是油葵中主要的酚酸化合物,近年研究表明,CGA和CA具有抗氧化、清除自由基、抑制突变和抗肿瘤等多种独特的生理功能。目前,国内油葵中CGA和CA的研究和开发还是空白。因此本研究对油葵资源的综合利用和开发具有重要的意义。本论文主要实验结果如下: 确定了一种同时测定油葵中CGA和CA的反相高效液相色谱(RP-HPLC)方法:采用ALLTIMAC_(18)柱(250mm×4.6mm ID,5μm),流动相为乙腈-2%乙酸溶液(15:85,v/v),流速为1.0mL/min,采用SPD-6AV紫外检测器,检测波长327nm;CGA和CA在18min内得到很好的分离。在0.05~0.35mg.L~(-1)的线性范围内,测定结果具有良好的相关性(r≥0.997)。测定的精密度为1.25%~1.46%,加标回收率为89.22%~95.29%。同时还测定了我国具有代表性的4种油用型和4种食用型向日葵中CGA和CA的含量。 研究和比较了三种不同的CGA和CA提取方法:(1)水溶液提取。在单因子实验的基础上,采用L_9(3~4)正交实验确定了水溶液提取CGA和CA的适宜工艺参数。结果表明:浸提温度60℃、浸提1.5h、浸提两次、固液比为1:30。(2)甲醇溶液提取。结果表明:浸提温度60℃、浸提时间1.5h;甲醇含量70%、固液比为1:30时CGA的提取率最高。(3)超临界CO_2流体萃取。采用三因子二次通用旋转回归设计实验,结果表明:乙醇添加量、萃取压力和萃取温度对CGA的提取率有极显著的影响,乙醇添加量15%、萃取压力63.94MPa、萃取温度72℃和萃取3h后,CGA提取率的理论极值为44.14%。三种提取方法中,甲醇的提取率最高,其次是水溶液提取法,而超临界CO_2流体萃取法最低。 探讨了大孔吸附树脂法对CGA和CA分离的影响。实验选择了九种大孔树脂为实验材料,研究和分析了各自对CGA和CA的吸附和解吸性能。结果表明:AB-8大孔树脂对CGA和CA适于CGA和CA的分离和精制;AB-8树脂的吸附条件:溶液pH值为4.5,8h内吸附量可达平衡吸附量的95%以上,饱和吸附量可达40.40mg/g;采用4BV、pH值为4.5水溶液2BV/h流速淋洗后,再以5BV的70%的乙醇溶液、1BV/h的流速解吸,可较好地分离CGA和CA,解吸率分别为75.02%和79.78%。 研究了高速逆流色谱法对CGA和CA分离纯化的效果。结果表明:选择合适溶剂系统己烷/乙酸乙酯/甲醇/0.5mol盐酸(3:7:5:5;v/v/v/v),在流动相流速1.5mL/min、鼓体转速1000rpm、进样浓度30mg/mL条件下,可以有效分离纯化CGA和CA,分离所得部分经RP-HPLC、~1HNMR和红外光谱法判定结构,基本证实为纯品。 以体外培养ECV-304内皮细胞为试材,选用氧化低密度脂蛋白诱导损伤的内皮细胞为模型,从ECV-304的形态、生长状况、细胞内抗氧化酶的活性、丙二醛和一氧化氮含量、乳酸脱氢酶释放率、总抗氧化能力的测定以及DNA损伤等方面,研究和探讨CGA、CA、抗坏血酸和柠檬酸对ECV-304内皮细胞的保护作用。结果表明:CGA和CA对ECV-304内皮细胞保护作用最好,抗坏血酸次之,最后是柠檬酸;CGA、CA呈典型的剂量依赖型关系。


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