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苹果铁高效基因型生物技术的研究——MxNrampl和MxIrtl基因的克隆

戚金亮  
【摘要】: 本实验以中国农业大学园艺植物研究所筛选到的一个苹果铁高效基因型——小金海棠(Malus xiao jinensis Cheng et Jiang)为试材,分别克隆了小金海棠的抗缺铁相关基因MxNramp1基因的752bp基因组DNA片段和Fe(Ⅱ)-转运蛋白基因(MxIrt1)的cDNA全长,为深入探讨小金海棠抗缺铁的分子机理奠定了基础。 (1)以异源的小麦Nramp基因片段和玉米Fe(Ⅱ)-转运蛋白基因(ZmIrt)片段为探针进行了杂交分析。Southern杂交结果表明:小金海棠基因组中存在该两家族基因。Northern杂交结果表明:在根中和叶中,Nramp基因均能得以转录且受缺铁胁迫的诱导而加强。Fe(Ⅱ)-转运蛋白基因在根中的转录也受到缺铁胁迫的诱导,并随缺铁胁迫处理天数的增加而加强。 (2)根据植物Nramp基因家族的功能保守区序列设计引物,通过常规PCR法从小金海棠基因组DNA中扩增出了MxNramp1基因的752bp的特异性产物;序列分析表明,该片段所推导的氨基酸序列与小麦Nramp基因片段(杂交用的探针片段)及水稻OsNramp3基因分别具有98%和83%的同源性。该片段的克隆为进一步克隆MxNramp1基因的全长提供了条件。 (3)根据植物Irt基因家族的功能保守区序列设计引物,首先通过常规PCR法从缺铁胁迫处理的小金海棠根系cDNA文库中克隆了Fe(Ⅱ)-转运蛋白基因MxIrt1的490bp的片段,然后根据测序结果设计引物,通过RACE法从该cDNA文库中克隆了MxIrt1基因的cDNA全长。序列分析表明,该基因的cDNA全长为1398bp,开放阅读框为1095bp,编码一个364个氨基酸的多肽,与番茄和豌豆中的该家族基因分别具有71%和69%的氨基酸同源性,是一种膜蛋白,具有1个信号肽序列,7个跨膜螺旋,3个N—糖基化位点和1个O—糖基化位点,分子量大约为39.174kD,等电点为8.07。 (4)成功地构建了小金海棠Fe(Ⅱ)-转运蛋白基因MxIrt1的酵母表达载体pDB~(1eu)—MxIrt1,并正在进行该基因的确切功能和亚细胞定位研究。 分析认为该两基因可能在小金海棠抗缺铁机理中起到重要的作用,为深入研究其功能奠定了基础。


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