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甘薯胚性悬浮细胞的遗传转化和转基因植株的有效再生

蒋盛军  
【摘要】: 本研究以甘薯品种栗子香的胚性悬浮细胞为材料,用根癌农杆菌菌株EHA101对根癌农杆菌介导的甘薯遗传转化进行了系统的研究。该菌株所携带的pROA93质粒上含有新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ)和β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)。结果表明,将达到对数生长期的根癌农杆菌菌液稀释至OD_(600nm)=0.5,与继代培养3d后的胚性悬浮细胞共培养,转化效率最高,适宜的共培养时间为4d。将共培养后的材料在含有300mg/L Carb和2.0mg/L 2,4-D的MS液体培养基中培养5~8d,再进行选择培养,有利于转化细胞的增殖。将转化材料在含有300mg/L Carb、25~75mg/L Kan和2.0mg/L 2,4-D的MS液体培养基中进行选择培养,结果表明,Carb和Kan的适宜浓度分别为100mg/L和50mg/L。选择培养2~4周后,共获得2453个直径约1mm的小细胞团,将这些小细胞团转移到添加100mg/L Carb、50mg/L Kan和2.0mg/L 2,4-D的MS固体培养基上,经过8~20周的选择培养,获得46个Kan抗性愈伤组织。将得到的Kan抗性愈伤组织转移到添加100mg/L Carb、25mg/L Kan和1.0mg/L ABA的MS固体培养基上,Kan抗性愈伤组织分化形成体细胞胚并发芽,最后转移到添加50mg/L Kan的MS基本培养基上,获得了138株再生植株。PCR和PCR-Southern检测结果表明,其中的104株(75.4%)再生植株是转基因植株。 利用该转化体系,对水稻巯基蛋白酶抑制剂(OCI)基因的遗传转化进行了研究。根癌农杆菌LBA4404携带质粒pBinh,该质粒携带OCI和NPTⅡ基因。将达到对数生长期的根癌农杆菌菌液稀释至OD_(600nm)=0.5,与继代培养3d后的胚性悬浮细胞共培养4d。将共培养后的材料在含有300mg/L Carb和2.0mg/L 2,4-D的MS液体培养基中培养5~8d,然后将转化材料在含有300mg/L Carb、50mg/L Kan和2.0mg/L 2,4-D的MS液体培养基中进行选择培养,总共获得1847个直径约1mm的小细胞团。将这些小细胞团转移到添加100mg/L Carb、50mg/L Kan和2.0mg/L 2,4-D的MS固体培养基上,经过8~20周的选择培养,获得19个Kan抗性愈伤组织。将得到的Kan抗性愈伤组织转移到添加100mg/L Carb、25mg/L Kan和1.0mg/L ABA的MS固体培养基上,Kan抗性愈伤组织分化形成体细胞胚并发芽,最后转移到添加50mg/L Kan的MS基本培养基上,获得了31株再生植株。PCR和PCR-Southern检测结果表明,其中的16株(51.6%)再生植株是转基因植株。通过对OCI转基因植株和阴性对照植株中水稻巯基蛋白酶抑制剂的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,结果表明OCI蛋白在转基因植株中有一定量的累积。 将GUS转基因植株和OCI转基因植株转移到温室,结果发现大部分转基因植株没有出现形态特征的变异。然而,在部分OCI转基因植株和GUS转基因植株上都发现叶片脉基色从淡褐色变为淡绿色、茎颜色从淡绿色出现局部淡褐色的变异。其中,GUS转基因植株中还出现1株丛生型的株型变异。这些变异究竟是由于基因转化造成的、或是由于体细胞无性系变异等其他原因造成的,还需要进一步的研究。


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