玉米中类似于mRNA的非编码基因ZM401 cDNA的克隆及其在玉米花粉发育中的作用

【摘要】： 随着人类及拟南芥基因组全序列的完成，对许多新的编码蛋白基因以及tRNA，rRNA，snRNAs基因的结构及功能给出了注释。但是真核生物基因组中只有一小部分为蛋白编码序列，而绝大部分则是不具有编码蛋白能力的非编码序列。对于大部分的非编码序列，其功能及其在基因组中存在的意义知之甚少。近年来科学家发现一类类似于mRNA，有mRNA的基本特征，但缺乏明显开放阅读框架的基因，它们主要以RNA分子的形式参与许多基本的生命活动，如胚胎发育，染色体失活，转录调控，生长发育及对胁迫的应答。 本研究小组通过差异筛选法，并结合冷噬菌斑筛选，从玉米成熟花粉cDNA文库中克隆到一个玉米花粉特异表达的非编码基因cDNA片段ZM401(663bp)。Northern杂交表明ZM401是一个玉米花粉特异表达的基因。本文采用5’RACE，3’RACE技术及重叠PCR获得了ZM401cDNA的全长(1149bp)。采用生物学软件对ZM401cDNA的全长序列和结构进行分析，该基因缺乏明显的开放阅读框架，序列中最长的可能的开放阅读框架仅编码89个氨基酸，具有poly(A)尾部结构，软件分析表明RNA分子具有稳定的二级结构，符合非编码RNA基因的特点，属于类似于mRNA的非编码基因这一类。RT-PCR分析表明ZM401基因从玉米花粉发育的四分体时期，单核期，双核期，成熟花粉均有表达，Northern Blot杂交结果表明ZM401从四分体时期，单核期，双核期，成熟花粉表达量依次增强，证明ZM401属于玉米花粉发育晚期基因。同时，Northern杂交显示ZM401基因在玉米花粉发育中以两种转录本形式存在。Southern杂交表明ZM401基因在玉米基因组中可能以单拷贝或低拷贝形式存在。 本文将四种分别在35S启动子或ZM13启动子驱动下的正向与反向植物表达载体通过基因枪法导入玉米胚性愈伤，经分子检测共得到27株Southern阳性转基因玉米，其中13株为转入正向表达载体的转基因玉米，14株为转入反向表达载体的转基因玉米。通过对转基因玉米花药形态的观察及花粉活力的测定，表明ZM401以正向方式整合的转基因玉米花药出现退化或皱缩现象，花粉经I_2-KI染色后，明显可见淀粉积累减少，花粉形态异常且大小不一。染黑率在1.2％-18.2％之间。转入反向表达载体的转基因玉米花药未见异常现象，花粉经I_2-KI染色后，花粉形态正常，黑染率在60％以上。通过对转正向表达载体转基因玉米花药的显微结构进行观察，表明由于ZM401的插入，导致出现以下异常现象，a)花粉发育不同步，b)花粉囊发育不同步，c)绒毡层与非转基因玉米相比出现退化延迟现象，d)花粉形态异常。通过对R1代转基因玉米的分子检测表明，ZM401能够稳定遗传，而且能够正常转录。在R1代转基因玉米中，同样可见由于ZM401的表达引起花药退化现象，花粉黑染率较低。结合对ZM401转录情况的分析，表明转基因玉米雄花产生退化，花药产生缺失，花粉形态异常及花粉育性的降低是由于外源ZM401基因的插入及正确转录的结果。从而证明ZM401基因在小孢子发育中具有重要的作用。