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马铃薯(Solanum tuberosum L.)花粉特异表达基因SBLR的克隆、分析及对玉米的遗传转化

郎志宏  
【摘要】: 高等植物花粉携带雄配子的遗传信息与雌配子结合,完成受精过程。在花粉发育过程中,有大量的基因表达,研究与花粉发育相关基因,可以从分子水平了解花粉的发育过程。花粉特异性启动子的驱动活性决定基因在花粉发育过程中的时空表达活性及表达量,所以对花粉中特异性启动子的研究,可以对花粉特异基因表达及调控机制有进一步的认识。 本研究用马铃薯花粉特异基因SB401 cDNA片段做探针,筛选马铃薯基因组文库,得到6个阳性克隆,对其中之一701克隆做进一步分析。用SacI切下λ701载体的9Kb插入片段,克隆到pGEM-7Zf(+)载体,完成了9Kb基因组片段的限制性酶切图谱分析,并对其中的4.5Kb片段进行了亚克隆和序列分析测定。 在得到的4459bp的序列中,有2320bp的5′端序列,TATA box和CAAT box分别位于-220~-214和-310~-306(起始密码子为+1);编码区为1239bp,由三个外显子和两个内含子组成,编码211个氨基酸和一个终止密码子,其中赖氨酸重量比为18.93%,是一个天然存在的高赖氨酸基因,该基因已申请专利。 为了确定2320bp的5′端序列是否具有启动活性以及它的组织特异性,构建了三个不同长度的片段(2247bp、1749bp和1338bp)与报告基因gfb连接的植物表达载体,用农杆菌的方法转化烟草,PCR、Southern杂交证明外源基因稳定整合到烟草的基因组中。荧光显微镜观察gfp基因表达情况,只在成熟花粉和花粉管有绿色荧光,而在叶片、茎和根中没有表达。通过GenBank、DDBJ和EMBL三大数据库检索,没有发现与2320bp的序列相似性高的其他启动子序列。所以说SBLR基因启动子是一个新的花粉特异性启动子。 为了进一步确定该启动子的活性控制区段,用5′端缺失的方法获得1212bp、1063bp、842bp、742bp、456bp、405bp、345bp、269bp和215bp九个不同长度的片段,与报告基因GUS连接,构建植物表达载体转化烟草。通过GUS酶活性检测和组织化学分析,证明影响其花粉特异性的顺式作用元件可能存在于-345~-269之间。 构建了两个植物表达载体19ZKgH(种子特异启动子19Z驱动SBLR基因)和AKgH(乙醇脱氢酶启动子Adh1驱动SBLR基因),利用基因枪轰击玉米胚性愈伤组织,得到转基因玉米植株。基因组PCR、点杂交和Southern杂交检测,外源基因已经稳定遗传至下一代。R_1代植株种子的蛋白质提高了8.1%~58.1%,赖氨酸提高了3.2%~54.8%,R_2代植株种子的蛋白质提高了19.2%~55.1%,赖氨酸提高了3.2%~51.6%,得到6个株系的蛋白质和赖氨酸均提高30%以上的育种材料,首次报道了利用优质蛋白基因的基因组DNA来提高农作物的营养品质。 通过RT-PCR、RT-PCR Southern blotting分析,SBLR基因的两个内含子都可以在转基因玉米植株中正确剪接,平均剪接效率为98.60%。这个结果证明了来源于双子叶植物(马铃薯)的内含子可以在单子叶植物中(玉米)正确高效剪接。


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