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有机磷农药的酶免疫化学研究

韩丽君  
【摘要】: 农药小分子的酶免疫化学研究可以是针对单个化合物制备特异性抗体,也可以针对一类化合物制备“簇特异性”抗体从而进行多残留免疫分析。本论文第一部分首次较为系统地针对常用的二甲氧基(硫代)磷酸酯类农药化合物的共性结构进行了多残留酶免疫分析研究,合成了三种具有共性结构特征的半抗原,并成功地得到了两种具有“宽谱特异性”的抗体。 根据我国常用的有机磷酸酯类农药的结构特征,将它们归为三类:(1) 芳环硫代磷酸酯类,如甲基对硫磷、杀螟硫磷、甲基嘧啶磷等;(2) 直链硫代磷酸酯类,如乐果、马拉硫磷等;(3) 乙烯基磷酸酯类,如久效磷、磷胺、速灭磷等农药,分别针对它们的共性结构合成了三种半抗原(分别简称为MP、SP和VP),以期得到对结构类似化合物具有“宽谱特异性”的多克隆抗体。针对这三种半抗原的活性基团特征,通过直接氨解法、重氮化法、混合酸酐法或活性酯法等方法,使之与不同的载体蛋白偶联,分别合成了人工抗原。以各种半抗原与BSA的偶联物作为免疫原进行动物免疫,分别得到了针对半抗原MP和SP的高效价抗体(VP免疫未成功)。获得的MP和SP抗血清与相应包被原结合的中点效价均为1∶12800倍,终点效价均大于50000倍。 采用间接竞争性ELISA方法,分别以甲基对硫磷和SP半抗原作为小分子竞争物,对其免疫分析条件进行了试验和筛选,在优化条件下建立了针对甲基对硫磷和SP半抗原的标准抑制曲线和回归方程。在此基础上进行了其它结构类似化合物的抑制试验。结果表明,甲基对硫磷对MP抗原抗体结合反应的I_(50)为0.13μg/mL,该抗体对杀螟硫磷和倍硫磷表现了较高的交叉反应性,二者的I_(50)分别为0.50μg/mL和0.35μg/mL。方法对这三种农药的检测限(I_(20))分别为6.7、20.9和12.1ng/mL,说明产生的抗体对三种农药均有识别能力,可用于三种农药的多残留检测。采用所建立的ELISA方法测得黄瓜中甲基对硫磷、杀螟硫磷和倍硫磷三种农药的添加回收率分别为83.10%~93.46%,80.45%~95.78%和74.89%~86.78%;C.V%分别为2.36%~10.36%,5.14%~7.14%和4.40%~6.34%,结果与GC测定数据基本吻合,在黄瓜中的最低检出浓度分别为0.003、0.01和0.006mg/kg,均低于相应的MRL值,符合残留分析的要求。 SP产生的抗体对乙酰甲胺磷、乐果、甲基对硫磷和马拉硫磷都表现了一定的交叉反应,四种化合物对SP抗原抗体结合反应产生抑制的I_(50)分别为2.66、3.31、8.26和14.9μg/mL,方法检测限(I_(20))分别为0.05、0.15、0.19和0.53μg/mL。表明针对这种化合物的共性结构产生的抗体对这些结构类似的化合物能够有一定的识别能力。 毒死蜱是一种中等毒性的广谱有机磷农药,在国内外农业生产中大量使用。本论文第二部分在国内首次进行了毒死蜱的免疫化学研究,并成功制备了针对毒死蜱的特异性抗体。从毒死蜱的磷酸酯乙氧基部位引入5-C间隔臂,通过混合酸酐法和活性酯法与不同的载体蛋白偶联,制备了人工抗原。以其BSA偶联物作为免疫原进行动物免疫,得到了对毒死蜱具有高度特异性和亲和力的高效价抗体。抗血清与包被原结合的中点效价为12800倍,终点效价大于50000倍。采用间接竞争性ELISA方法对免疫分析条件进行了试验和优化,建立了毒死蜱的标准抑制曲线和回归方程。 中国农业大学博士学位论文 摘要 一 毒死婢对抗原抗体结合反应的I。。为 76.snghL,方法对毒死婢的检测限(I。。)为5.2 nghL。除甲 基毒死婢以外uR%为66.9%),抗体对其它有机磷农药均不表现交叉反应。土壤、黄瓜和河水中 毒死婢的添加回收率分别为73.sl%~89.45%、76.93%~102.吕%和89.30%~103.2%,Cv%分别为 5.28%~9.83%、7.62%~12.25%和4.04%~5.18%,与GC测定数据基本吻合,最低检出浓度分别 为0刀05mghg、0.003mghg和0.08pgh,均低于其在蔬菜中的MRL值,符合残留分析的要求。利 用抗体进行的酶免疫分析方法灵敏度、准确性较好,操作简便,适于大量样本的快速筛选,可作 为快速测定工具予以开发和利用。


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