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棉铃虫细胞色素P450的诱导、纯化及其性质研究

郑明奇  
【摘要】: 尽管P450s酶系在昆虫中的重要性已经十分清楚,但由于多型P450共存于同一昆虫体中,要真正了解和调控P450的功能,需要剖析不同P450的底物特异性,首先必须分离纯化出单型P450,因此P450分离纯化在P450研究中具有重要的意义。 棉铃虫是一种在世界范围内普遍发生的重要害虫,能导致多种不同作物的严重损失。为深入了解棉铃虫P450的结构与功能,我们就棉铃虫P450的诱导、分离纯化及性质进行了研究,主要研究结果如下。 比较萘、五甲基苯、槲皮素、芸香苷和单宁酸对棉铃虫微粒体P450含量的影响发现:萘和五甲基苯能明显诱导微粒体P450,中肠微粒体P450的含量分别提高了2.60和2.34倍,脂肪体微粒体P450的含量分别提高了2.51和3.15倍。槲皮素、芸香苷和单宁酸对脂肪体微粒体P450未表现出诱导作用,对中肠微粒体P450有一定的抑制作用,并导致棉铃虫对溴氰菊酯的敏感性增加。 对CHAPS、Lubrol PX、Emulgen 911和胆酸钠四种去垢剂的比较研究发现:CHAPS对中肠和脂肪体微粒体P450的增溶效率最高,Lubrol PX、Emulgen 911和胆酸钠较差。CHAPS增溶中肠和脂肪体微粒体P450的最适浓度分别为0.5%和0.5%或0.8%。在0.5%浓度下,四种去垢剂均未使中肠和脂肪体微粒体P450变性。 PEG沉淀法被用于P450的初步纯化。当PEG的浓度为2%时,约30%的微粒体蛋白和10%的P450被沉淀;PEG为5%时,约55%的微粒体蛋白和20%的P450被沉淀;PEG为8%时,约78%的微粒体蛋白和30%的P450被沉淀;PEG为11%时,约85%的微粒体蛋白和70%的P450被沉淀。其中,8%CHAPS适合于微粒体P450的初步纯化。经PEG沉淀后,中肠微粒体P450纯度提高了2.1倍,回收率为72%;被沉淀出的蛋白主要集中在14.4-40kDa和66-97kDa范围内。 本文建立了HPHIC(Phenyl-5PW)分离P450的优化条件:①检测波长为405nm;②流速0.5ml/min;③50min线性梯度洗脱,从100%HICA_2至100%HICB。在该条件下,中肠微粒体经HPHIC分离后,P450主要存在于馏分7(tR=39′0″-44′0″)和馏分8(t_R=44′01″-49′0″)中;与微粒体相比,P450纯度提高3.04倍,回收率为55.3%。 本文还建立了HPIEC(DEAE-5PW)分离P450的优化条件:①检测波长为405nm;②流速0.5ml/min;③40min线性梯度洗脱,从100%IECA_2至100%IECB_2。在该条件下,馏分7和馏分8中的P450均在t_R=5-7min范围内洗脱出来;与微粒体比,P450纯度提高6.3倍,回收率为17.3%。 SDS-PAGE(银染)显示:经HPIEC分离后,馏分7得到分子量为59±1.0kDa和48±1.9kDa的两条蛋白带;馏分8得到分子量为55±0.2kDa和46±1.9kDa的两条蛋白带。


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