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猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白抗原表位的分析

王玉娥  
【摘要】: 猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine respiratory and reproductive syndrome virus,PRRSV)引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的传染病。本研究利用噬菌体展示技术,结合ELISA和基因表达等技术对PRRSV结构蛋白的抗原表位进行了鉴定与分析,为PRRSV的结构蛋白免疫特性与功能研究以及表位疫苗的设计等奠定了基础。 1.运用GoldenKey分子生物学软件对PRRSV BJ-4结构蛋白的抗原表位及其二级结构进行了分析和比较,从中筛选13段显示表位特征的氨基酸残基序列,用PCR技术扩增相应的核苷酸片段,将其插入到噬菌体表达载体M13KE,结果预测的13个表位可在噬菌体表面得以展示。 2.利用PRRSV BJ-4阳性血清和鼠源抗重组结构蛋白抗体,采用间接ELISA方法对噬菌体展示的表位进行了鉴定。结果表明,在预测的13个抗原表位中,鉴定出7个表位。GP2a的aa110~aa136(GP2110)可被鼠源抗重组GP2a抗体所识别;GP3的aa81~aa91(GP381)能够被PRRSV阳性血清和鼠源抗重组GP3抗体识别;GP4的aa53~aa67(GP453)和aa107~aa115(GP4107)可被PRRSV阳性血清和鼠源抗GP4抗体识别;GP5的aa30~aa39(GP530)、aa161~aa169(GP5161)和aa190~aa200(GP5190)可被PRRSV阳性血清和鼠源抗重组GP5抗体识别。其中,GP2110、GP453和GP530等3个抗原表位与已报道的抗原表位相似,其余4个抗原表位(GP381、GP4107、GP5161和GP5190)是新确认的PRRSV抗原表位。 3.采用噬菌体随机7肽库对单克隆抗体GE3识别的抗原表位进行了鉴定。从第三轮亲和筛选的噬菌体中随机挑取17个克隆进行功能鉴定,结果表明8个克隆与mAb GE3具有较强的特异性结合力并可以被PRRSV阳性血清阻断,测序发现7个克隆具有核心序列:P/EKPHF,该序列与PRRSV N蛋白aa50~aa55(P/EKPHF)具有较高的同源性。用PRRSV阳性血清和鼠源抗PRRSV抗体采用间接ELISA进行鉴定,结果表明筛选到的噬菌体克隆可以与血清发生特异性反应,从而初步确定了单克隆抗体GE3所识别的抗原表位。 4.将编码单克隆抗体GE3所识别的抗原表位的核苷酸片段插入到原核表达载体pGEX-4T-2中,实现了GE3所识别的抗原表位在大肠杆菌中的表达。经SDS-PAGE分析表明,表达的GST-融合蛋白与预期大小相符。Western-blot分析表明表达产物与PRRSV阳性血清没有反应性,而ELISA分析表明表达产物可与PRRSV阳性血清和单克隆抗体发生反应。由此说明单克隆抗体GE3所识别的抗原表位可能是存在于N蛋白上以KPHF为核心的构象型表位。


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