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草莓栽培品种离体再生及遗传转化的研究

尹淑萍  
【摘要】:本研究以草莓(Fragaria ananassa Duch)多个栽培品种为试验材料,通过对影响叶盘离体再生不定芽和农杆菌(Agrobacterium)介导的遗传转化若干因子的研究,建立起高效的草莓叶盘离体再生不定芽系统和遗传转化系统。利用CBF1基因进行了遗传转化,获得了“丰香”、“哈尼”“土特拉”和“达斯莱克特”四个品种的转基因植株,分子生物学分析以及植株抗寒性生理指标测定的结果证明,CBF1基因已经整合进转化植株并得到了表达。 主要研究结果如下: (一)草莓栽培品种的离体再生 1.基因型是影响草莓离体再生的关键因子。供试的18个基因型均有一定的不定芽再生能力,但再生能力有明显差异。其中“丰香”、“哈尼”、“土特拉”、“新星2号”、“6-40”、“新星1号”、“达斯莱克特”、“童子1号”、“意大利1号”、“林果四季”、“宝交早生”的再生能力较强,芽再生频率在100%~63.3%之间;“6-42”、“星都1号”、“高斯克”的再生能力较弱,在31.9%~4.3%之间。不同基因型所要求的培养基激素组合不尽相同。 2.培养基中的生长调节物质是影响草莓离体再生的重要因素。(1)再生培养基中附加一定的细胞分裂素和生长素对于不定芽的再生是必需的,在没有细胞分裂素和生长素,或单独附加某一类激素的培养基中,外植体不能再生不定芽。(2)不同水平的6-BA(1.0,2.0,3.0,4.0,5.0mg/l)对不定芽的诱导率有较大的影响。容易再生的基因型所需6-BA的水平较低,一般低于3.0;较难再生的品种,需要提高6-BA的水平,达到4.0甚至5.0mg/l,才能获得较好的再生效果。(3)在与6-BA组合的四种生长素中,以2,4-D诱导的效果最好,且所需的2,4-D水平较低(0.1,0.5mg/l);(4)与TDZ相比,6-BA的有效浓度在1.0~5.0mg/l之间,TDZ的有效浓度范围较宽,在1.0~8.0mg/l之间。(5)使用TDZ诱导不定芽再生,其效果既与TDZ的浓度有关,也与TDZ和不同生长素配合使用有关。(6)对于再生能力差的基因型,可以考虑使用高浓度的TDZ以提高其再生频率,但TDZ并非对每种基因型都有好的再生效果。(6)不同品种所需的最适激素水平各有不同,需对不同基因型进行分别筛选。 3.大多数供试品种离体再生的基本培养基以MS为适宜,但对“达斯莱克特”这一基因型,MS无机盐+B_5有机物更有利于不定芽的再生;同一基因型草莓,叶盘再生效果比叶柄好。暗培养对草莓叶盘再生不是必需的,但4~6d的暗培养可以提高“土特拉”的再生频率,对于“哈尼”则没有明显影响;以叶盘的近轴面或远轴面接触培养基,对叶盘再生的影响不显著;低温处理可使“哈尼”和“土特拉”的再生频率明显下降。 4.在Km 20 mg/l的培养基上接种“哈尼”的叶盘,完全抑制了不定芽的再生,因此将Km 20mg/l作为转化植株的筛选浓度。在培养基中附加Carb 375mg/l,能够有效地抑 功国冲业才笋厚全居戈‘ 尹按声二.蔚穿春增而禅库命厚全及蘑撵转化衬研分 制农杆菌的生长,此时“哈尼”不定芽再生率够有下降。继续提高Carb浓度至500 ms/1, 再生频率明显下降。 (二)CBFI基因对草毒的遗传转化 1.基因型是影响草蓦遗传转化的重要因素。对再生频率较高的“丰香”、“哈尼”、“土 特拉”、“达斯莱克特”四个基因型进行了转化,分别得到了3.57%,4.81%,2.巧%,13.7% 的转化频率。 2.经乙戴丁香酮(AS,50,100 mg/l)、水杨酸(sA,50,100 mg/l)分别处理6h的 农杆菌摄染叶盘,可以显著提高“哈尼”的转化频率;对于叶柄,经AS 100m幼处理后 转化频率由8.33%提高到了18.33%,其它处理对转化率没有影响。 3.对于LBA 4404介导的基因转化,叶盘在菌液中浸泡1一7 min都是可行的;农杆 菌和外植体共培养时间在2一4d的范围内,都得到了较好的结果,以共培养4d为佳。在 分化培养基中预培养2一4d的“土特拉”,抗性芽的诱导率高于未经处理及预培养6d的处 理,预培养Zd时抗性芽的诱导率最高。对于“哈尼”和“丰香”,预培养则降低了抗性芽 的诱导率。 4.选择方式对草幕的遗传转化率影响很大。对于“土特拉”,前期选择不利于转化细 胞的生长,未能获得转化芽,宜采取延迟选择或后期选择的方式。对于“丰香”,延迟选 择和后期选择都明显提高了转化率,尤以后期选择更为明显。对于“哈尼”,前期选择和 延迟选择对转化率的影响不大,但后期选择同样促进了转化率的提高。因此,对于草墓叶 盘的遗传转化,共培养之后不立即进行抗性筛选,而在脱菌培养基中恢复生长一定阶段, 对于获得转化体很重要。后期选择时,抗生素能够有效地淘汰非转化芽,从而避免嵌合体 的产生。 5.以0.5~大小、带有2一4个叶原基的生长点为外植体进行转化,“丰香”、“星都 1号”、“星都2号”等3个品种分别得到了37.5%、20%、33.3%的转化率。但利用生长 点进行转化存在着取材时间受限制、操作耗时、带菌严重、污染率高以及容易出现嵌合体 等局限性。 6.对198个抗性植株株系进行了PCR检测,其中54个株系的DNA经扩增后产生了 与阳性对照相同的特异扩增带,其片段大小约为640bp,与c刀尸了相符。对PcR阳性植 株和对照植株进行了杂交检测,PCR阳性


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