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甘蓝型油菜与向日葵高γ-亚麻酸基因工程研究

郝彦玲  
【摘要】: γ-亚麻酸(GLA;C18:3-Δ ~(6,9,12))是一种对人体具有重要营养、保健和医疗功能的多不饱和脂肪酸,由于其生物资源匮乏,导致人们在日常膳食中缺乏GLA。因此,利用转基因油料作物大规模的生产GLA成为学术界研究的热点。本课题从卷枝毛霉中克隆Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因,与种子特异性启动子连接,农杆菌介导转化油菜与向日葵,旨在通过基因工程技术提高传统油料作物(油菜和向日葵)的γ-亚麻酸含量来满足功能食品和生化制药的需求。 (1)克隆和鉴定Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因:通过RT-PCR方法从丝状真菌卷枝毛霉中克隆Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因,PCR产物亚克隆到酵母表达载体pYES2.0上,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒pYES412,用醋酸锂方法转化到营养缺陷型酿酒酵母菌株INVScI中,在SC-Ura合成培养基中筛选酵母转化子,在合适的培养基及培养条件下,加入外源底物亚油酸,经半乳糖诱导后,收集菌体,通过气相色谱对转化酵母进行脂肪酸成分分析,结果表明:γ-亚麻酸占总脂肪的50.07%。因此,该工程菌株在工业微生物发酵法生产γ-亚麻酸方面具有很大的应用前景。 (2)克隆和鉴定向日葵种子特异性启动子:通过PCR方法从向日葵基因组中克隆种子贮藏蛋白Ha ds10 G1基因起始密码子前200bp、500bp和1300bp的序列,构建到植物表达载体pCAMBIA1301上驱动GUS基因的表达,农杆菌介导法转化烟草NC89,通过对转基因烟草不同组织进行GUS染色证明1300bp序列具有启动外源基因在种子中特异表达的功能。 (3)构建携带Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因的种子特异性和组成型植物表达载体:将Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因分别构建在35S启动子和种子特异性启动子驱动的植物表达载体上,表达载体的特点是目的基因和GUS基因在两个独立的表达盒上,有利于通过GUS染色对再生植株进行初步鉴定。 (4)转Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因甘蓝型油菜的获得:采用农杆菌介导法将Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因导入甘蓝型油菜中双6号,PCR和Southern杂交分析表明,获得10株携带Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因的阳性植株。 (5)向日葵遗传转化体系的建立及转Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因的获得;以向日葵的茎尖为外植体,通过农杆菌介导法,以抗性培养7天的外植体GUS基因纯合表达为指标测定转化率。结果表明:潮霉素适宜的筛选浓度为10mg/L,农杆菌侵染浓度OD_(600)=0.8,果胶酶(0.05%)与纤维素酶(0.1%)共同消化外植体30min,共培养温度24℃,共培养培养基中添加乙酰丁香酮100μmol/L,向日葵茎尖GUS基因纯合表达率高达32.8%。通过PCR分析表明,11株阳性植株,但目前为止,未获得可育性转基因植株,实验正在对转基因向日葵早花引起的败育问题进行研究。


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