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革兰氏阳性中度嗜盐菌甘氨酸甜菜碱转运蛋白基因的克隆和功能分析

卢伟东  
【摘要】: Halobacillus trueperi分离白美国盐湖,能够在含0.5%~25%NaCl(w/v)盐浓度条件下生长,其最适生长盐浓度为5%~10%。~(13)C-NMR(核磁共振)检测到在含10%NaCl(w/v)的SWYE培养基上生长的H.trueperi细胞内积累高浓度的甘氨酸甜菜碱。根据革兰氏阳性菌甘氨酸甜菜碱转运蛋白氨基酸的保守序列设计简并引物一对,经PCR获得大小约1 kb的核苷酸片段。将扩增片段用地高辛标记成探针,与用不同限制性内切酶完全酶切的H.trueperi总DNA片段作Southern杂交,结果显示在EcoRI酶切片段的5.1 kb处有阳性信号。通过反向PCR扩增获得beth基因片段的侧翼序列。通过BLAST比较,证实获得beth基因的全部编码序列。BetH属于BCCT家族。将包括整个betH基因ORF框及可能的启动子核苷酸序列在内的2.6kb的片段克隆到pUC18载体上,转入到大肠杆菌甘氨酸甜菜碱缺失株MKH13中,使该菌株能够在含甘氨酸甜菜碱的高盐M9培养基上生长,而对照实验不能生长。使用~(13)C-NMR技术,检测到在E. coli(pUH25)中有甘氨酸甜菜碱的积累。 在H. trueperi发现有甘氨酸甜菜碱ABC转运系统。首先通过该转运系统ATP结合蛋白氨基酸的保守序列设计简并引物一对,获得约560bp的部分核苷酸序列。将扩增片段用地高辛标记成探针,与用不同限制性内切酶完全酶切的H. trueperi总DNA片段作Southem杂交,结果显示在EcoRI酶切片段的2.6 kb处有阳性信号。通过反向PCR扩增获得ATP结合蛋白基因片段的侧翼序列。通过BLAST比较,表明获得完整的ATP结合蛋白基因ORF框序列及其上游的核苷酸序列。再次,根据甘氨酸甜菜碱ATP转运系统底物结合蛋白的氨基酸保守序列设计下游简并引物,与ATP结合蛋白的上游简并引物组合,经PCR扩增获得2.1kb的条带,测序后通过BLAST比较,结果显示获得ATP结合蛋白基因的部分序列、通透酶的全部编码序列和部分甘氨酸甜菜碱结合蛋白基因的核苷酸序列。将2.1kb PCR产物用地高辛标记为探针后,与用不同限制性内切酶完全酶切的H. trueperi总DNA片段作Southern杂交,结果发现在AflⅡ酶切片段的5.2kb处有阳性信号。通过反向PCR扩增获得探针的侧翼序列。BLAST比较结果显示获得完整的甘氨酸甜菜碱结合蛋白编码框序列及其下游的核苷酸序列。进一步在opuA基因的上下游序列分别设计引物,从H. trueperi基因组DNA中扩增出所预期大小的片段,测序验证已获得opuA基因的全序列。 Halobacillus sp. D8是从新疆达坂城地区盐湖分离的革兰氏阳性中度嗜盐菌,在含10%NaCl的SWYE培养基上生长良好。将其总DNA用Sau3AI部分酶切后,收集4~15kb大小的酶切片段,克隆到用BamHI酶切的pUC18中,构建Halobacillus sp. D8基因组文库,共获得约9000个重组质粒。利用上述合成的简并引物,PCR扩增获得甘氨酸甜菜碱转运蛋白beth基因约1kb大小的片段。将PCR扩增片段用地高辛标记探针,利用原位杂交和菌落PCR从基因文库中获得含有阳性信号的重组质粒。将重组质粒测序,插入片段大小为4 kb左右,通过BLAST比较,结果显示含有三个ORF框,其中一个为甘氨酸甜菜碱转运蛋白,对其氨基酸组成进行疏水性分析,推测为含有12个跨膜域的跨膜蛋白,属于BCCT家族。


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