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促减数分裂甾醇对小鼠卵母细胞减数分裂的作用研究

谢辉蓉  
【摘要】: 哺乳动物卵母细胞从开始形成到生长成熟,和减数分裂过程是密不可分的。在体内,卵原细胞会停止有丝分裂、启动并进入减数分裂而转变为卵母细胞,进而被周围的体细胞包围形成卵泡。卵母细胞减数分裂随之停滞于第一次减数分裂的前期,在卵泡中通过漫长的生长发育过程后,在一定的刺激条件下才恢复减数分裂而成熟。因此减数分裂恢复的调控研究对于了解卵母细胞的形成、生长发育和成熟都是至关重要的。促减数分裂甾醇(meiosis-activating sterol, MAS)能诱导体外培养的卵母细胞恢复减数分裂成熟,因此自从MAS被发现以来就引起了研究者的注意,但是对于其具体的作用和机制还在争议之中,鉴于此,本文探讨了MAS对小鼠卵母细胞减数分裂启动和恢复的调节作用。 MAS有两种,即FF-MAS(follicle fluid-meiosis activating sterol)和T-MAS(testis-meiosis activating sterol),都是胆固醇生物合成途径中的中间产物,FF-MAS由羊毛甾醇14α-脱甲基酶(CYP51)合成,然后由Δ14-还原酶进一步转化为T-MAS,在卵巢中主要积累FF-MAS。抑制CYP51酶的抑制剂,如azalanstat(RS-21607)和RS-21745等,均能抑制MAS的合成,降低MAS的积累;而抑制Δ14-还原酶的抑制剂,如AY9944-A-7等,能抑制FF-MAS向T-MAS的转化而造成FF-MAS的积累;还有一些物质,如制霉菌素,能阻止MAS向下游的代谢而造成其积累,本文主要通过应用这些物质降低、或增加组织细胞中内源性MAS的积累,来研究MAS的作用。 首先利用小鼠胚胎卵巢的体外无血清培养模型,培养妊娠14天(14 day post-coitus, 14 dpc)小鼠胚胎卵巢,分别添加能促进MAS积累的AY9944,制霉菌素,和能抑制MAS产生的RS-21745进行处理,结果表明:0.025、0.0625利0.125μM的AY9944-A-7与25、50和75iu/ml的制霉菌素能显著提高卵巢中形成卵泡的总数量,但是对生长卵泡数和卵泡直径的作用不同;而MAS合成抑制剂RS-21745能够显著降低形成卵泡的总数量。由于卵泡的形成发生在卵母细胞减数分裂的启动之后,以上由于MAS积累提高卵泡形成的总数但对卵泡生长并无显著作用的结果提示,MAS可能对与卵泡形成有关的过程进行调节,即可能促进了卵原细胞启动减数分裂转变成卵母细胞,进而促进了卵泡的形成。 其次,建立了两个小鼠卵泡的短期无血清培养模型。模型Ⅰ,从未经促性腺激素处理的未性成熟小鼠卵巢中取出的卵泡,在体外培养24h;模刑Ⅱ,从经过促性腺激素eCG处理后的未性成熟小鼠卵巢中取出的卵泡,在体外培养6h。根据卵泡的直径大小将卵泡分组,分别为100-170μm、180-200μm、210-250μm、260-350μm利360-400μm等5组。分别添加促性腺激素如FSH利hCG,并添加azalanstat和RS-21745,以及AY9944-A-7处理培养的卵泡,研究它们对卵泡包裹的卵母细胞(follicle-enclosed oocytes, FEOs)的减数分裂成熟以及退化死亡率的影响。在模型Ⅰ中,FSH(0.01-0.2iu/ml)和AY9944-A-7(5、25和50μM)单独处理都能诱导卵泡直径为180-400μm的FEOs恢复减数分裂成熟。对卵泡直径为260-400μm的FEOs,hCG(1.0,10iu/ml)显示了和FSH相似但相对较弱的作用。在模型Ⅱ中,FSH(0.050iu/ml)或hCG (10iu/ml)单独使用都能提高卵泡直径为260-400μm的FEOs的GVBD发生率,但hCG处理组和对照组差异不显著。FSH(0.050iu/ml)和hCG(10iu/ml)结合使用结果显示它们对提高FEOs的GVBD发生率具有协调效应。添加RS-21745(50、100μM)利azalanstat(50μM)能显著抑制FSH诱导的、或者FSH和hCG共同使用所诱导的FEOs的减数分裂恢复。 随后,使用免疫组化分析方法对CYPS!蛋白在小鼠卵巢、体外培养的卵泡中的分布和表达 进行了检测。结果表明,在未经eCG处理的未性成熟的小鼠卵巢中,CYP51蛋白在间质细胞和 膜细胞中表达较高,其它细胞中仅有背景水平表达:经过eC(〕处理后,CYP51蛋白在卵丘细胞、 颗粒细胞中表达升高,而在经过随后hCG的处理后,CYP51蛋白的表达继续增加。在黄体细胞 中CYP51蛋白表达也较强。在各个处理和各级的卵母细胞中,卵母细胞中仅有背景水平的CYP51 蛋白表达。从未经eCG处理的未性成熟小鼠中取出的卵泡经过24h培养后,FSH(0.051以ml) 处理组的卵泡中卵丘细胞和壁层颗粒细胞CYPS!蛋白表达水平要明显高于hCG(101以ml)处理 组.的和对照组的。从经eCG刺激的小鼠卵巢中取出的卵泡培养6h后,FSH和hCG也能促进CYP51 的表达。以上抑制剂能抑制促性腺激素诱导的FEOs减数分裂成熟,和CYP51蛋白在卵丘细胞和 颗粒细胞中的表达受促性腺激素的诱导的结果,提示MAS介导了由促性腺激素诱导的小鼠卵母 细胞的成熟。 利用卵母细胞自发减数分裂成熟模则,还探讨了MAS在小鼠卵丘包裹的卵母细胞(CEOs) 白发成熟过程中的可能作用。结果显示,在不引起CEOs显著退化或死亡的浓度范围内,aza!anstat (1一40”M)和Rs一21745(1一50林M)均呈剂量依赖性地降低小鼠CEos的GVBD发生率,在高 浓度,40林Maza一anstat和50林M Rs一2一745几乎阻断T eEos的减数分裂恢复。而Av9944一A一7 (5一100林M)不能显著影响cEos的GvBO,甚至在引起cEos的显著退化和死亡的高浓度时 (50一100林M)也如此


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