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蚕豆CDPK基因克隆、表达分析和玉米V-ATPase A亚基磷酸化位点鉴定

刘贯山  
【摘要】: 钙依赖蛋白激酶(CDPKs)是一类仅在植物和部分原生生物中存在的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。CDPKs是Hetherington和Trewavas(1982)在豌豆中首先报道的,并由Harmon等(1987)在大豆中第一次得到纯化和鉴定。自从Harper等(1991)从大豆中首次克隆出编码CDPK的基因以来,至今已在16种高等植物、6种低等植物和4种原生生物中克隆出95个CDPK基因。CDPKs是一个多基因家族,其中拟南芥有34个CDPKs。CDPKs在植物钙信号转导中具有重要的作用,越来越多的证据表明,在植物碳氮代谢、离子和水分跨膜运输、细胞骨架调节、气孔运动调节、生长发育调节以及生物和非生物胁迫应答反应中均有CDPKs的参与。 本研究采用RT-PCR技术并结合RACE策略,成功地首次从蚕豆下表皮和叶片中克隆了编码CDPK的全长cDNAr VfCPK1和cDNA片段VfCPK2,并对VfCPK1的表达特征进行了初步研究。研究结果表明,用RT-PCR技术,以CDPKs激酶区的保守氨基酸设计的一对简并引物,从蚕豆下表皮中扩增到了3个141 bp(141-1、141-2和141-3)的cDNA片段;用RACE技术,以141-1序列设计的一对基因特异性引物,克隆到全长cDNA序列VfCPK1。用RT-PCR技术,以CDPKs激酶区和连接区的保守氨基酸设计的一对简并引物,从蚕豆叶片中还扩增到了3个618 bp(618-1、618-2和618-3)的cDNA片段;用RACE技术,以618-1序列设计的一对基因特异性引物,克隆到了还缺少5’末端的cDNA片段VfCPK2。 VfCPK1的全长为1785 bp,其中编码区为1479bp,可编码493个AA,5’非编码区为127bp,3’非编码区为179bp,中间含有加尾信号AATAAA,末尾是poly(A)。由编码区推测的VfCPK1的493个氨基酸序列具有已报道的CDPK的所有典型结构特征,由N端到C端可分为可变区、激酶区、连接区和调节区四个结构域。N端的可变区有26个氨基酸残基,没有豆蔻酰化所必需的保守序列MGXXC(S/Q)XXT,因此推测VfCPK1可能是水溶性蛋白。VfCPK1具有明显的Ca~(2+)/钙调素依赖蛋白激酶及丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的激酶区以及类似于钙调素的钙结合区。激酶区长264个氨基酸残基,具有所有11个保守的亚结构域和15个对于真核生物丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶所必需的保守的氨基酸残基。连接区有31个氨基酸残基。C端的调节区有162个氨基酸残基,有4个非常保守的EF手性钙结合结构域。 推测的VfCPK1蛋白质序列与植物中的许多CDPKs具有很高的同源性,包括大豆种子CDPKa(同源性82%;29892113)、大豆SK5(CDPKα;同源性82%;116054)、大豆种子CDPKb(同源性80%;29892204)、马铃薯RiCDPK2(同源性79%;15289760)、大豆CDPKβ(同源性79%;2501764)、水稻CDPK(同源性78%;34147319)、玉米ZmCPK11(同源性78%;31747505)等。与拟南芥34个CDPKs相比,VfCPK1与AtCPK12、AtCPK4和AtCPK11的同源性最高,分别为77%、75%和74%。 通过Northem和Western blot分析,我们研究了蚕豆钙依赖蛋白激酶VfCPK1在蚕豆不同部位包括根、茎、叶、叶肉和下表皮中的mRNA和蛋白质水平上的表达情况以及不同外界胁迫处理对VfCPK1表达的影响。实验结果表明,无论是在mRNA还是蛋白质水平上,VfCPK1都是在叶片中的表达量显著高于根和茎中的表达量,尤其是在下表皮中的表达量最大,而在根和茎中的表达量低。因此,VfCPK1主要分布于蚕豆的叶片中,尤其在下表皮中。 当用不同浓度的PEG和不同的处理时间处理蚕豆叶片时,在mRNA和蛋白质水平上, 垮℃尸犬了在叶片中的表达量都有增加。当PEG处理浓度为20%时,学,尤了的表达量最大。无 论是在转录还是蛋白质水平上,20%PEG处理Zh后,吠沪尤少在叶片中的表达量开始升高, 处理sh后,表达量达到最大。当用100林M ABA对蚕豆叶片胁迫处理不同时间后,叨护犬了在 叶片中的转录水平的变化呈现出类似于20%PEG不同时间处理的表达模式。这表明,干早胁迫 或外源ABA诱导了叨,犬了在蚕豆叶片中的表达。当用Cacl:处理叶片时,叨,犬了在蚕豆叶 片中的表达显著增加,而用Mgcl:和Nacl处理时,叨,犬了的表达没有变化,说明c扩+不仅是 cDPK的酶活性依赖因子,而且还能刺激cDPK的基因表达。另外,低温(4℃)和高温(37℃) 处理对巧℃尸犬了在蚕豆叶片中的表达没有影响。 本论文还研究了玉米根液泡膜蛋白V.ATPaseA亚基磷酸化对V州ATPase活性的影响并鉴定了 A亚基磷酸化位点。结果表明,A亚基的磷酸化可明显提高V.ATPase的ATP水解活性和H+转运 活性。进一步研究表明,A亚基的潜在磷酸化位点为Ser525。就我们所知,这是首次确定植物 v一ATPaseA亚基的磷酸化位点。据推测,玉米根V一ATPase的A亚基可能是在这个丝氨酸位点被 CDPK磷酸化。


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