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固氮芽孢杆菌的分离、鉴定及其glnB基因的初步研究

丁延芹  
【摘要】: 本文在中国农业大学科学园区采集了小麦和玉米的根际土,从北京市朝阳区洼里分别选择不同环境采集2个黑麦草根际土壤样品和1个柳树根部的土壤样品,分别从这5个土壤样品中分离固氮的芽孢杆菌。 首先利用芽孢杆菌中芽孢的抗热性将土壤溶液在100℃沸水中煮10-15分钟,然后用选择性无氮培养基进行初筛得到29株菌落形态不同的菌株;接着用固氮酶结构基因nifH的特异性引物对这29株菌进行PCR扩增,结果表明其中7个菌株具有nifH基因,这7个菌株的编号依次为:C4、C5、G1、G2、W5、T1和T7。对这7个菌株的nifH片段进行了DNA序列分析,结果表明在由DNA序列推测的氨基酸水平上,菌株C5、W5、T1和G2的NIFH与Klebsiella pneumoniae的NIFH具有较高(97-98%)的相似性,菌株C4和G1与Azospirillum lipoferum、Azospirillum brasilense和Burkholderia brasilensis具有较高(91-100%)的相似性,菌株T7与Paenibacillus odorifer具有较高(97%)的相似性。采用乙炔还原方法对这7个菌株的固氮酶活性进行了测定,其中4个菌株具有固氮酶活性,菌株G2和T7的固氮酶活性相对来讲比较高,分别达到660.0nmol乙烯/mg蛋白和292.5nmol乙烯/mg蛋白,但用同样方法却没有测出菌株G1、T1和C5的固氮酶活性,它们的最佳固氮条件还有待于发现。 在上述试验的基础上,本文分别用生理生化性状、全细胞脂肪酸成分分析、16SrDNA序列分析及DNA-DNA杂交实验对这7个含有nifH的菌株进行了鉴定。结果表明其中5株菌属于芽孢杆菌属(Bacillus),另外2株菌属于类芽孢杆菌属(Paenibacillus)。在这7株被鉴定的菌株中,菌株T1被鉴定为Bacillus cereus;W5与Bacillus marisflavi的生理生化性状、16SrDNA序列及G+C mol%含量都极为接近,但由于缺少参考菌株,尚不能将它鉴定到种水平(Bacillus sp. W5);菌株G1、C4和C5被鉴定为Bacillus megaterium;G2的性状与Paenibacillus polymyxa的性状接近,但DNA-DNA杂交的同源性仅为51%,其分类地位有待于进一步确定;T7菌株在生理生化特征上,如葡萄糖等碳源的利用等方面有别于其它已知类芽孢杆菌,其全细胞脂肪酸的主要成分是十五碳反义式支链饱和脂肪酸(占47.78%),在根据16S rDNA序列构建的系统发育树中,与T7聚在一起的种分别为:Panibacillus pabuli、Paenibacillus amylolyticus和Paenibacillus illinoisensis,但DNA-DNA杂交结果表明,T7与它们的同源性分别为50.62%、9.14%和46.80%,所以我们认为T7可能是Paenibacillus属的一个新种,其种名暂定为Paenibacillus salicis sp. nov.。 本文还从菌株G2和T1中,分别克隆了编码P_(Ⅱ)蛋白的glnB基因,用SOUTHERN杂交的方法验证了G2的glnB,结果表明在G2中可能有2个拷贝的glnB基因。本文还在氨基酸水平上比较了菌株T1和G2的glnB与E. coli、Kpneumonia、B. subtilis及一些联合固氮菌的glnB基因的同源性,结果表明它们在氨基酸水平上的相似性为69.47%。 本文还以B. subtilis中编码P_(Ⅱ)蛋白的nrgB基因和A. brasilense中编码GlnB蛋白的glnB基因及编码GlnZ蛋白的glnZ基因设计引物,试图从上述7个具有nifH基因的菌株中扩增得到编码P_(Ⅱ)蛋白的基因,但都没有得到预期的结果,因此推测在这些菌中的编码P_(Ⅱ)蛋白基因与B.subtilis中编码P_(Ⅱ)蛋白的nrgB基因和A. brasilense中编码P_(Ⅱ)蛋白及GlnZ蛋白的glnB和glnz基因有所不同,它们的固氮调节机制也可能不同。


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