马铃薯（Solanum tuberosum L.）花粉特异表达基因ST901的克隆及其功能研究

【摘要】： 在高等植物中，花的发育是一个复杂的过程，涉及到由营养分生组织(或花序分生组织)向花分生组织的转变，花的形态建成以及雌、雄配子体的发育和分化。在对花器官发育的研究中，对雄蕊发育的研究由于与雄性不育密切相关而尤为引人注目。花粉作为植物雄配子体世代的代表，在开花植物的整个生命过程中起着重要而独特的作用。对花粉发育过程中特异表达基因的研究，科学家们希望从分子水平上阐明小孢子发育的本质。近几年来花粉发育相关基因的克隆以及功能的研究，已经成为国际植物分子生物学界的研究热点。 以同源探针筛选马铃薯基因组文库，得到四倍体马铃薯基因组DNA—ST901，基因全长2889bp，含3个外显子(长度分别为475bp，140bp，39bp)和2个内含子(长度分别为472bp，253bp)；5’端含有1447bp的启动子区段，该区段具备一般启动子的基本元件TATAbox和CAATbox；3’非编码区长63bp，具HindⅢ酶切位点，没有发现保守的加尾信号。ST901基因编码产生217个氨基酸残基组成的亲水性蛋白，PI值为4.33；蛋白中富含谷氨酸和赖氨酸，分别占蛋白总重的27％和17％；具四个不完全重复序列V-V-E-K-K-N／E-E，其核心序列K-K-E-E类似于哺乳动物小鼠的微管结合蛋白MAP1B的结合位点：此外，还具有三个潜在的糖基化位点和两个酪蛋白激酶磷酸化位点。此序列已在GenBank中注册，登录号为AY526087。 计算机软件分析ST901基因核苷酸、氨基酸序列的相似性，结果表明，ST901基因编码区与探针SB401、与高赖氨酸基因SBLR、与番茄TSB具有较高的相似性，它们可能来源于马铃薯的一个基因家族。采用RT-PCR和Northem杂交技术研究ST901基因表达的时空特异性，结果表明，ST901基因的表达具有组织特异性，特异地在马铃薯成熟花药中表达，在幼嫩花芽、未成熟花药、茎及叶等其他组织器官中均没有检测到该基因的转录产物。属于花粉发育的晚期基因。基因组Southem杂交分析表明，ST901基因以低拷贝形式存在于四倍体马铃薯基因组中。 为进一步确认ST901基因的表达模式，利用PCR技术及启动子序列内部的酶切位点，克隆得到六个不同长度的启动子片段(1368bp、680bp、335bp、319bp、300bp和288bp)，分别与gus基因连接构建植物表达载体，农杆菌转化烟草(马铃薯)。通过对GUS酶活性的组织化学定位分析，表明，ST901基因启动子驱动gus基因特异地在成熟花粉和花粉管中表达，ST901基因具有花粉表达特性；且288bp(-297至-9)(ATG定为+1)的启动子区段足以驱动gus基因在花粉中的特异表达，ST901基因启动子的花粉顺式表达元件可能位于-297至-9之间。 为研究ST901基因的功能，构建了四种ST901基因的正向、反向表达载体(分别在CaMV35S启动子和ST901自身启动子驱动下)，农杆菌法导入马铃薯和烟草中。通过对转基因植株花粉、花药形态的观察和花粉活力的测定，表明ST901启动子驱动的ST901基因在转基因植株中的表达造成花粉严重败育，花粉粒皱缩，扁瘪、塌陷，缺乏内容物；转反向表达载体的马铃薯花粉育性仅为对照的5.2％，育性下降94.8％。转正向表达载体在烟草正常花粉粒的百分比较对照植株降低了42％。CaMV35启动子驱动ST901基因在转基因烟草、马铃薯中的表达同样导致植株的雄性不育，这是通过影响转基因植株花药的发育而实现的。通过对转正向表达载体的转基因烟草和携带有反向表达载体的马铃薯植株不同发育阶段花药形态及显微结构的观察，表明由于外源ST901基 中国农业大学博士学位论文中文摘要 旦口口旦口旦组旦旦口里组旦组目组 因的插入，导致出现以下异常现象:部分转基因烟草植株的雄蕊不同程度的花瓣状，形成花瓣/ 雄蕊嵌合体;花药皱缩、干瘪，呈褐色;雄蕊原基分化异常;花粉囊发育畸形，缺乏正常的花粉 囊和小抱子发生组织;具有异常的分裂原基;药室发生合并;花粉囊发育不同步;花粉形态异常， 花粉数量大大减少，最终导致花粉败育。这些结果表明，召仰01基因在花粉发育过程中发挥着重 要作用。