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褐煤降解菌斜卧青霉P6木素过氧化物酶的分离纯化及特性研究

杨金水  
【摘要】: 褐煤是植物残体经过漫长的地球物理化学过程转变而来的一种低阶煤,具有与木素相似的结构。褐煤作为一种资源在工、农、医、牧等领域具有重要用途及应用潜力,但由于其疏水性和立体结构的复杂性,降解性很低。木素过氧化物酶(LiP)是木素类物质降解的关键酶之一。目前国外研究的热点集中在白腐真菌来源的木素过氧化物上,国内的研究刚刚起步。 斜卧青霉菌P6是本课题组选育的一株具有强降解褐煤活性的菌株。本研究发现其在BM平板上生长时,4天即可产生明显的苯胺兰脱色现象,10天时可产生弱的鞣酸聚集现象,揭示P6可分泌高活性的过氧化物酶和微量的漆酶。在液体培养的情况下,第4天时,过氧化物酶的活性即可达到最大。PAGE活性染色结果显示,P6可分泌两种主要的过氧化物同工酶和多种酯酶,未检测到内葡聚糖酶和木聚糖酶活性。 对斜卧青霉菌P6发酵培养4天的培养液,依次采用80%饱和度的(NH_4)_2SO_4盐析、DEAE-纤维素和CM-纤维素离子交换层析、Sephadex G-100凝胶过滤,PAGE凝胶电泳以及SDS-PAGE凝胶电泳等分离与纯化技术,得到电泳纯的木素过氧化物酶,经SDS-PAGE鉴定为单一条带。表观分子量为46.3KDa。酶的比活性由最初的0.05U/mg提高到7.52U/mg,纯化了150.4倍,活性回收率为19.6%。以藜芦醇为底物,在25℃,pH3.0的琥珀酸钠缓冲液中与底物反应时的K_m值为0.565mmol/L,Vmax为0.088mmol mg~(-1) protein min~(-1);具有较宽的pH范围和温度稳定性,最适pH为4.0,最适温度为45℃。对纯化后LiP,测定了其N-末端的10个氨基酸残基,其N末端序列为VLLPADEKNA,与Genbank中的白腐真菌的过氧化物酶进行同源性比较,发现它具有真菌MnP和其它过氧化物酶的保守序列VLL,但是与真菌LiP无同源性。 对纯化得到的P6木素过氧化物酶降解褐煤的活性研究发现,在H_2O2的激活下,对褐煤具有明显地降解作用,降解后小分子黄腐酸含量显著提高,降解产物比原褐煤具有更高的H、O、N含量,而C含量明显下降。并且降解产物可提高豌豆种子的发芽率并明显缩短发芽时间。 根据N末端氨基酸序列设计特异性引物,利用RT-PCR方法扩增得到一条约2000bp的cDNA片段,序列测定的大小为1956bp。通过序列比对,与已报道的Piloderma croceum菌的mnp2基因具有45%的同源性。翻译后的氨基酸序列比对发现,具有6个主要的ORF和2个次要的ORF,具有过氧化氢酶的保守氨基酸残基。 关于青霉产生木素过氧化物酶的研究在国外只有零星报道,但尚未有关于其纯化及特性的研究,国内也无此方面的报道。由于青霉菌本身的易培养性和生长优势,其LiP具有研究价值。本研究分离、纯化了青霉菌P6的LiP,对其特性进行了系统研究。为进一步阐明斜卧青霉菌P6木素过氧化物酶的酶学特性,克隆其编码基因,并构建高效表达体系,开发新的木素过氧化物酶奠定了基础,具有重要的理论和实际意义。


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