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传染性法氏囊病病毒对CEF细胞某些基因表达的影响和传染性喉气管炎病毒的重组

李义平  
【摘要】: 本论文包括三个部分:1)传染性法氏囊病病毒(IBDV)对鸡成纤维细胞(CEF)某些基因表达的影响和病毒在法氏囊与粪便中的定量研究;2)传染性喉气管炎病毒(ILTV)的重组;3)新城疫病毒(NDV)的分型研究。 第一部分: 本实验用IBDV感染鸡成纤维细胞(CEF),采用定量实时RT-PCR选检出一个在IBDV感染过程中稳定表达的基因,并以此作为内参基因,用于测定CEF细胞中其它基因表达变化以及病毒在感染鸡的法氏囊和粪便中的定量研究。 用IBDV感染CEF细胞,在7天的感染时间中选择了十二个基因进行检测,这些基因编码:β-actin,28S rRNA,18S rRNA,GAPDH,β-2-microglobulin,TBP,PRKG1,IL-13Ra,DDX1,UBC,Ovotransferrin和G6PDH。实验结果表明,β-actin,28S rRNA,18S rRNA和GAPDH基因在感染期间是稳定表达的,β-actin基因是中丰度表达基因,而且在定量和非定量分析(定量和非定量RNA用于反转录)中没有统计学意义上的不同。因此,β-actin基因是研究感染IBDV的CEF细胞中基因表达和病毒载量的最佳内参基因。同时讨论了这些基因在实验感染过程中的具体变化。 用β-actin作为实时定量RT-PCR的内参基因,以SYBR green染料方法定量研究IBDV感染的CEF细胞中某些基因的表达。在7天的感染时间中,STAT 3,MIP-3α,IL-8,IFN 1-2启动子,2,5-寡腺苷合成酶A,MHC类型1,MHC类型2,IRF-1和TVB受体基因表达上调高于10倍;凋亡抑制子1,IFNAR1,ALVRl,α-2,3-硅基转移酶,IL-6的基因表达上调低于10倍;NFκB p65,BLRcp38,IFNAR2基因的表达恒定;TRAIL样基因的表达下调。所有上调的基因都表现为感染病毒滴度依赖型,用高滴度病毒感染的CEF细胞组中,基因表达上调的时间明显早于用低滴度病毒感染的细胞组。结合实验结果,还对这些基因在宿主抗病毒反应中的可能作用与宿主对病毒感染的反应路径进行了讨论,细胞对IBDV感染的反应是IFN路径。 应用SYBR green的定量实时RT-PCR方法检测感染IBDV的鸡的法氏囊和粪便中的病毒载量(相对于β-actin)。实验鸡分别感染IBDV疫苗株D78,vvIBDV丹麦株和经典株F52/70。除了D78以外,vvIBDV和F52/70都可在感染后第1天的法氏囊和第2天的粪便中被检测出。vvIBDV和F52/70在感染后第2,3天的法氏囊中有较高的量(相对于第1天),在第3天的粪便中有较高的量。D78在接种第4天和第8天的法氏囊中有较高的量,但只在一只鸡的粪便中被检测出。本实验所建立的应用SYBR green的定量方法在定量法氏囊中的IBDV是实用的。 实验建立了Taqman检测系统,并用于定量研究疫苗株D78和vvIBDV,D78和F52/70在感染鸡法氏囊中的相对量的关系。实验设计了一对IBDV引物和三个分别针对IBDV三种类型(疫苗株,经典株和vvIBDV)的探针,同时设计β-actin基因特异性引物和探针。三个IBDV探针可分别区分三种不同类型的IBDV,可在一个PCR反应管中同时实现对相应毒株的检测和定量分析。在用D78免疫两天后用vvIBDV攻毒的鸡中。D78与vvIBDV成反向关系,D78量多的法氏囊中, 中国农业大学博_l:学位论文 vvlBOV的量就少,而078量少的法氏囊中,。IBOV量就多。在用078免疫21天后再用。IBDV 或F52/70攻毒的鸡的法氏囊中,不能检测出wlBDV和F52nO,只在一些鸡中检测出D78。此 方法可应用于IBDV的分型,也可以对同一组织中不同类型的IBDv进行定量研究。实验结果对IBDV 的致病性和IBDV与宿主相互作用研究提供了重要的参考信息。 第二部分: 实验克隆了中国ILTv EZ株的带侧翼序列的TK基因,得到质粒pCRT-FTK,并进行序 列分析。然后用Acc川和、恤n91I删除TK基因内部677 bp的序列。在此删除位点分别插入 CMV-GFp一polyA不11 SV40一GFp一polyA表达盒分别得到质粒pFTK一SG和pFTK一SG。将新城疫融合 基因(F)分别插入到质粒pFTK一CG和pFTK一sG中的GFP的上游,与GFP构成融合表达框,得 到质粒pFTK一FG和pFTK一sFG。另外,构建TK缺失的不带外源基因的重组质粒pFTKO.用 质粒pFTK一Cq pFTK一sq pFTK一FG和PFTK一sFG与ILTv基因组DNA共转染LMH细胞和鸡 原代肝细胞,用荧光显微镜检测带荧光的ILTV重组子。病毒重组子在鸡原代肝细胞中传第二代 时,还可见到荧光,说明带GFP和F一GFP的重组ILTV在转染时己经产生。发现CMV启动子比 SV40启动子有更强的启动效率。重组子的纯化与性质测定有待进一步鉴定。 第三部分: 应用RT一PCR结合探针杂交的方法对新城疫病毒(NDV)进行分型。先用感染NDV的鸡胚尿 囊液建立实验方法,再用感染鸡的组织进行该方法的应用效能检测。VC22是毒力株特异探针, NC22是非毒力株特异探针。用地高辛(DIG)标记探针3’端,在尼龙膜上与NDV RT‘PCR产物进 行斑点杂交。两个探针能很好的区分来自感染鸡胚尿囊液的NDV,并可区分感染组织中的NDV 强弱毒。对各毒株的杂交检侧结果与脑内致病指数(I CPI)判定的强弱毒结果相一致,整个检测 过程可在1天内完成。实验对两个探针的特异性和Nc22的灵敏度进行测试,Nc22能检测到将1价, EIO州ml的La sota毒株稀释到1了稀释度或800fg的病毒RNA。本系统在临床样品的检测上有一 定的应用价值.


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