自然突变基因分离体系的初步建立与苹果柱型突变体类型的鉴定

【摘要】： 柱型苹果是果树分子生物学研究和苹果分子育种的珍贵试材，鉴定柱型突变体类型并建立适合于克隆自然突变基因的新体系是分离柱型突变基因的前提。 本研究以苹果野生型品种旭和突变型品种威赛克旭为材料，研究了柱型苹果的突变体类型，初步建立了两个克隆自然突变基因新体系，结果如下： 1、以S1核酸酶和CELI核酸酶突变检测法为基础，初步建立了两个新体系，该体系不需要预先知道目的基因及其产物的序列、功能等信息，所以适合于研究自发突变基因；以定向诱变的玉米叶绿素a／b结合蛋白的启动子为操作对象，验证了其原理的可行性，并在基因组水平上研究了其克隆苹果柱型突变基因的可行性； 2、优化了S1核酸酶突变检测体系，新体系更加稳定、快速，适合于功能基因组学研究的要求； 3、苹果柱型突变与细胞分裂素关系密切，证据如下： (1) 植物学鉴定：遮光处理威赛克旭叶片变黄说明它不是油菜素内酯的突变体；比较两者的形态差异与发育的关系，证明茎粗处于突变的核心地位，而节间次之； (2) 比较两者解剖结构发现突变之后中皮层加厚，细胞横向变大，数量也增加，但径向没有变长，暗示着与细胞分裂素的关系； (3) 对比两者的春梢和秋梢内源激素含量发现突变之后GA3、GA4、ZR和IAA含量升高，表明柱型苹果不是赤霉素合成突变体； 4、利用苹果GA-20氧化酶基因建立了拟南芥矮化突变体： 利用RT-PCR技术从苹果新捎中扩增了与GA-20氧化酶基因高度同源的序列，全长1.179kb；比较发现该基因在旭和威赛克旭间的存在一定的多态性；RNA干扰试验证明该基因控制营养生长，是GA-20氧化酶基因家族成员，半定量PCR的方法比较研究发现这个赤霉素生物合成限速酶在两者之间表达水平差异不大。