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鹅MHC classⅠcDNA克隆、基因组结构、等位基因多态性分析

胡团军  
【摘要】: 主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex,MHC)指集中于某一染色体、编码与免疫应答直接相关的一类细胞膜糖蛋白基因群。其功能不仅限于移植排斥反应,它还与机体对外源性抗原的免疫应答之间存在关联。这种发现引起了人们对MHC研究的浓厚兴趣。 从DDBJ/EMBL/GenBank基因库中读取鸡、其它鸟类、两栖类、爬行类和哺乳类的MHC I类基因,进行序列分析,在MHC class I α_2链两个半胱氨酸保守区域的外侧设计一对简并引物:使用Trizol试剂盒,提取鹅脾脏总RNA,用RT-PCR方法从鹅的脾脏fcDNA中克隆MHC I α_2链部分基因并测序,根据测序结果重新设计一上游引物。使用3′-RACE PCR方法克隆MHC I α_2到3′一端PolyA序列;再根据所克隆的MHC I α_2链测序结果设计一下游引物,使用cDNA双链合成试剂盒和PCR Library kit试剂盒克隆5′-UT到MHC I α_2部分序列,然后,将5′和3′一端两段测序结果拼接起来,重新设计一对上下游引物,克隆MHC I的全基因序列。在获得全基因序列的基础上,用LA-PCR方法从鹅基因组DNA中克隆了MHC I类分子的基因组序列并分析其基因组结构。及从另外4羽不同个体鹅的脾脏组织得到fcDNA,使用RT-PCR方法克隆MHC I等位基因全序列,运用生物信息学技术对测序结果进行其多态性分析。最后使用RT-PCR方法检测了MHC I在鹅不同组织器官中的表达水平。 通过对其基因组结构、等位基因多态性、多肽结合区(PBD)的氨基酸置换率和三级结构进行量化分析。结果显示Aney-MHC I成熟蛋白全长348个氨基酸,在α_1和α_2区有14个高置换位点。基因组DNA由8个外显子和7个内含子组成。根据其遗传距离可将5个个体的Aney-MHC I分为3个类型(-UA~-UC)。Ancy-MHC I氨基酸序列中保留了HLA-A2与抗原多肽结合的7个关键性氨基酸。不同等位基因序列同源率为85.1~98.9%,鹅与鸡的序列同源率为61.0~66.7%,与人和鼠的同源率为40.8~43.4%。与人HLA-A2晶体结构比较,Ancy-MHC I在α_1区有2个氨基酸的缺失变异,多态性位点主要存在于α螺旋和β折叠区。MHC I分子进化树也进一步揭示了鹅与鸡、鸭、两栖类、哺乳类以及人类的进化关系。RT-PCR检测到Ancy-MHC I在心、脑、肝、脾肾和皮肤中表达,但表达水平有差异。


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