猪圆环病毒2型原位杂交检测方法的建立及应用

【摘要】： 猪圆环病毒2型(PCV2)是引发断奶猪多系统衰竭综合征(PMWS)和猪的皮炎与肾病综合征(PDNS)等有关疾病的重要病原。为深入研究PCV2的致病机理，本研究在国内首次建立了PCV2特异性原位杂交检测方法。 参照GenBank发表的PCV2 ORF2基因序列设计引物，利用PCR扩增得到341bp的核酸片段，用随机引物法制备出地高辛标记的核酸探针。特异性检测结果表明，该探针与PCV1、PRRSV、PPV、PRV等不发生反应；敏感性检测结果表明，该探针可检测的最低DNA含量为2pg。 用PCV2 BF毒株人工感染10头40日龄长白猪，分别于感染后第3、7、14、21、42天剖杀取材，制备多聚甲醛固定石蜡包埋的组织切片，用核酸探针检测组织中的病毒分布。结果显示，在人工感染后第3天，仔猪的淋巴结、胸腺、肺脏、脾脏、鼻粘膜中即出现阳性杂交信号；第21天，肝脏、肾脏、心脏、脑、胃、回肠等组织出现阳性信号。在整个实验过程中，会厌软骨、膀胱、皮肤、肌肉等组织以及未感染对照猪组织均未检测到阳性信号。 用建立的PCV2原位杂交方法检测5头临床疑似PMWS仔猪的主要组织，可在部分仔猪的淋巴结、肺脏、脾脏、肝脏、肾脏等组织中检出阳性信号，与PCR检测结果的符合率为93.3％。自然发病猪组织中病毒感染的靶细胞数量明显多于人工感染猪，且阳性信号分布更为密集。