GacS/GacA双因子调控系统和群体感应系统在生防荧光假单胞杆菌2P24中的作用

【摘要】： 菌株2P24和CPF-10分离自小麦全蚀病自然衰退土壤。2株细菌均可产生多种抗菌物质，如2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-DAPG)、氢氰酸(HCN)、嗜铁素、蛋白酶。平板对峙测定表明2株细菌对细菌性青枯菌(Ralstonia solanacearum)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)等多种植物病原真菌和细菌具有明显的拮抗作用。温室生测表明2P24对番茄青枯病和小麦全蚀病等土传病害具有较高防效。本研究通过16S rDNA序列同源性分析及生理生化测定将2P24株菌鉴定为荧光假单胞杆菌生物型Ⅰ(Pseudomonas fluorescens biovar Ⅰ)，将CPF-10菌株鉴定为荧光假单胞杆菌生物型Ⅴ(Pseudomonas fluorescens biovar Ⅴ)。为了探索生防菌主要生防因子的作用机制以及相关的分子调控，本研究对菌株2P24的抗生素2,4-DAPG、quorum-sensing(QS)系统和GacS／GacA双因子调控系统进行了初步研究。 首先，利用同源重组构建菌株2P24的2,4-DAPG合成基因定位突变体，并对突变体进行基因互补，通过检测突变菌株和恢复突变菌株的抗生素产量和生防效果确定了2,4-DAPG在菌株2P24生防功能中的关键作用。 其次，构建菌株2P24的高效基因组文库，利用QS系统中信号合成基因在E.coli DH5 α的异源表达，以A.tumefaciens NTL4(pZLR4)为信号检测菌，从菌株2P24基因组文库中克隆到QS系统的组分pcoI和pcoR基因。通过对pcoI基因的缺失突变和互补分析发现，pcoI至少合成3种QS信号，而且QS系统与抗菌代谢物2,4-DAPG，HCN和嗜铁素的产生无显著关系，而与biofilm的形成，小麦根部的定殖，环境适应性密切相系。温室生测表明，pcoI突变体对小麦全蚀病和番茄青枯病的防效显著低于野生型。证明了QS是一个与菌株2P24生防能力相关的重要调控元件。 此外，使用PCR介导的方法从菌株2P24的基因组文库中克隆到调控基因gacS。对gacS基因进行突变和基因互补，通过功能互补证明GacS严格控制2,4-DAPG等次生抗菌物质和QS信号的产生，并与生防能力呈显著正相关。通过在2P24和GacS突变菌中构建pcoI::lacZ转录融合子，证明GacS在转录水平调控pcoI基因的表达。由此说明GacS／GacA双因子调控系统是一个与生防相关的全局调控因子。