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蝗虫EPV sph基因及OaEPV与绿僵菌及化学农药混用的杀虫效果

李永丹  
【摘要】:本文对意大利蝗痘病毒Calliptamus ualicus EPV(CiEPV)、两伯利亚蝗疸病毒Gomphocerussibiricus EPV(GsEPV)、红胫戟纹蝗痘病毒Dociostarus kraussi EPV(DkEPV)包涵体蛋白基因进行了克隆、测序、分析,对亚洲小车蝗痘病毒Oedaleus asiaticus EPV(OaEPV)的增效性进行了初步研究,并生物测定了OaEPV与化学杀虫剂混用的杀虫效果,这些工作有利于蝗虫痘病毒在生物防治上的开发利用。 CiEPV、GsEPV与DkEPV sph基因序列全长分别为4242 b p、4488 bp与 4242 bp,分别包含2922bp、2967bp与2922bp的开放阅读框架,编码的蛋白分子量为109.2、111.1及109.4 kDa。序列分析表明,CiEPV、GsEPV与DkEPV与直翅目昆虫痘病毒的包涵体蛋白,氨基酸水平上同源性都大于75%:而与鳞翅目EPV和鞘翅目EPV的包涵体蛋白,氨基酸水平上同源性都小于20%。CiEPV、GsEPV与DkEPV的包涵体蛋白分别包含19、21、19个半胱氨酸残基,并且聚集在蛋白的C-末端。基因的5′端非编码区包含了基因转录的启动区域,具有典型痘病毒的晚期基因启动标志序列TAAATG。在启动子ATG上游45个核苷酸的区域,可能为基因转录的启动区域,直翅目昆虫此序列的同源性达98%。基冈的3′非编码区,均发现另一个不完全的开放阅读框架(ORF),与sph基因方向相反。此序列与MsEPV的潜在蛋白基因MSV072序列同源性80%以上。 接种最为1.67×10~5OBs/头的OaEPV与1.67×10~5孢子/头的绿僵菌混合感染黄胫小车蝗及东亚飞蝗,比用同量的绿僵菌孢子单独感染两种试虫,杀虫效果更为明显,增效率7d分别可达41.7%,28.9%。OaEPV的增效作用与OaEPV的用量有关,OaEPV的剂量越大,增设作用越强。OaEPV经2×SDS包涵体碱性裂解缓冲液裂解,离心,分别用上清液及沉淀与绿僵菌孢子混合感染黄胫小车蝗,上清液的增效活性比沉淀大2.5倍。用三种不同方法(2×SDS包涵体碱性裂解液法,0.02 mol/L NaOH裂解法,8 mol/L尿素裂解法)裂解OaEPV所得蛋白液与绿僵菌混用,生测结果表明,包涵体裂解液法制备所得蛋白增效活性最高,NaOH裂解法次之,尿素裂解法制备的蛋白几乎没有增效活性。将OaEPV用包涵体碱性裂解液裂解后,用葡聚糖G-200凝胶柱层析进行分离,出现两个洗脱峰,这两个峰的洗脱液浓缩后进行生物测定,初步表明增效作用主要为第二个峰的蛋白片段。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,第二个峰的蛋白片段的分子量为40 kDa左右。 OaEPV与化学杀虫剂辛硫鳞、甲基对硫磷、溴氰菊酯、氰戊菊酯、卡死克、抑太保及西维因7种农药混合感染黄胫小车蝗的LC_(50),均比单独使用农药均有所下降,卡死克、抑太保的下降率达49.0%与42.8%,效果最为明显。


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