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枯草芽孢杆菌R21-4抗菌蛋白的分离提取与应用

贾洁  
【摘要】:作为一类重要的天然防腐剂,微生物产生的抗菌蛋白由于具有低毒、高效、可被肠道蛋白酶降解、不易破坏肠道微生物菌群平衡等特点,其研究和开发已引起人们的普遍关注。芽孢杆菌在自然界分布非常广泛,多数芽孢杆菌的抗菌物质具有抗菌谱广,对酸碱度要求不高,热稳定性好,易于进行分子加工等特点。这些都为开发新型天然防腐剂以及生防制剂提供了很好的条件。枯草芽孢杆菌R21-4是一株分离自腊肠的芽孢杆菌,具有广谱抗菌效果以及较好的热稳定性和酸碱稳定性。因而,本研究对枯草芽孢杆菌R21-4的抗菌蛋白进行深入研究,旨在为新型抗菌物质的开发与应用提供理论依据。主要内容如下: 生理生化以及16SrRNA基因序列测定和聚类分析软件的分析鉴定菌株R21-4为枯草芽孢杆菌。抗菌谱的测定证实了R21-4抗菌蛋白对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母和霉菌均有一定的拮抗作用,特别是对食品中的常见腐败菌,如蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、产气荚膜杆菌、产气肠杆菌、荧光假单胞菌等均有明显抗菌效果。 对枯草芽孢杆菌R21-4抗菌蛋白进行了分离提取,结果表明采用60%饱和度的硫酸铵可以沉淀82.5%的抗菌蛋白。经Sephadex G-75洗脱后,抗菌蛋白被分成两种组分,其中组分1仅对蜡样芽孢杆菌有拮抗性,而组分2中的抗菌蛋白对蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌均表现较好的抑菌效果,Tricine-SDS凝胶电泳检测结果表明,组分2中蛋白质的分子量在6.4-7.2kDa之间。 琼脂块再生法和液体培养法证实了枯草芽孢杆菌R21-4抗菌蛋白对细菌的作用方式是杀菌;镜下观察表明,抗菌蛋白使棉花黄萎病菌的孢子萌发受到抑制,菌丝扭曲畸变,进而原生质凝聚,最后导致菌丝断裂。 枯草芽孢杆菌R21-4经过自然选育及紫外诱变后筛选得到一株具有良好遗传稳定性的枯草芽孢杆菌R21-15。与对照相比,它抑制大肠杆菌的活性提高了58.49%。枯草芽孢杆菌R21-15抗菌蛋白具有较好的热稳定性,对胃蛋白酶、蛋白酶K和胰蛋白酶部分敏感。 枯草芽孢杆菌R21-4抗菌蛋白在鲜肉和肉馅中的应用试验表明,采用浸渍法对鲜肉进行防腐处理,各处理组防腐效果均好于对照。与640AU/mL抗菌蛋白相比,3%乳酸钠的防腐效果要更好,而640AU/mL抗菌蛋白的防腐作用要优于0.1%山梨酸钾的防腐作用。采用液体试管培养法用6种防腐液对肉馅中的微生物进行抑菌试验,不同浓度的抗菌蛋白均表现较好的抑菌效果,37℃培养12h后,与对照相比,128AU/mL抗菌蛋白处理组的细菌总数降低了近6个数量级;在24h内64AU/mL和128AU/mL的抗菌蛋白处理组抑菌效果均明显优于0.1%山梨酸钾处理组。


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