棉花（Gossypium hirsutum L.）GhMAP1-LC3基因的表达特征与抗血清的制备

【摘要】：棉花(Gossypium hirsutum L.)GhMAP1-LC3基因是在本实验室前期工作中克隆到的,其氨基酸序列与微管结合蛋白1A(MAP1A)和1B(MaP1B)的第三条轻链(LC3)保守区的104个氨基酸残基完全匹配,因此推测其为棉花中的微管结合蛋白基因。 本研究以陆地棉石远321(Gossypium hirsutum L.)为材料,应用实时定量PCR技术分析了GhMAP1-LC3基因的表达特点并制备了能够专一识别MAP1-LC3蛋白的抗血清。主要结果如下: 1.采用CTAB-PVP法提取棉花各组织RNA,得到纯度高、完整性好的RNA。 2.利用实时定量PCR技术比较了GhMAP1-LC3基因在棉花各组织中的表达情况,在下胚轴、-3DPA胚珠、30DPA纤维与35DPA纤维中没有检测到该基因的表达,在胚根、叶片、花瓣、花药以及0DPA胚珠、5DPA胚珠、10DPA纤维、15DPA纤维、20DPA纤维、25DPA纤维中均检测到了GhMAP1-LC3基因的表达,其中以20DPA纤维中的表达量最高。 3.采用CTAB-PVP法提取棉花叶片基因组DNA,并应用基因特异性引物对其进行PCR扩增。基因组DNA的扩增产物与20DPA纤维cDNA的扩增产物大小相同,表明该基因不含内含子。 4.将该基因的开放读码框克隆至pET30a表达载体中,导入大肠杆菌JM109(DE3)菌株中诱导表达,得到占菌体总蛋白2%的目的蛋白表达量。 5.应用亲和柱层析及聚丙烯酰胺凝胶电泳回收技术纯化得到目的蛋白。 6.以纯化的蛋白免疫小鼠,得到抗血清,经Western blotting检测,可以专一识别MAP1-LC3蛋白。