双重套式PCR对小鼠桑椹胚OPS法冷冻后性别鉴定

【摘要】：本实验通过对“双重套式PCR对不同取样胚胎性别鉴定灵敏度测试”及“OPS法冷冻胚胎双重套式PCR性别鉴定”的研究,进一步完善了哺乳动物胚胎性别鉴定技术体系,尤其是冷冻胚胎的性别鉴定技术。为哺乳动物胚胎、尤其是冷冻胚胎的性别鉴定在生产实践中获得更高的效率提供了有价值的实验参数。 在测定双重套式PCR微量扩增体系的灵敏度实验中,从Gene Bank中检索出不同品种小鼠的SRY、ZFX基因各自共有序列片段,运用DNAMAN6.0、Primer3.0及Oligo6.0进行引物设计与分析,建立了昆明白小鼠特异的SRY/ZFX双重套式PCR性别鉴定体系并进行优化。以桑椹胚卵裂球为模板通过扩增来测定双重套式PCR扩增体系的灵敏度,按卵裂球数量的不同分为5组,对应的卵裂球个数分别为1、2、3、4、5个及以上。根据有效扩增结果得出双重套式PCR的灵敏度.结果表明:第1组(卵裂球个数为1),有效检出率为85%(34/40),污染率为7.5%(3/40),漏检率为7.5%(3/40)。随着卵裂球个数的增多,有效检出率逐渐升高,而污染率和漏检率则呈逐渐下降趋势。第2组,有效检出率达到91.7%(33/36),污染率为2.8%(1/36),漏检率为5.6%(2/36)。第5组(卵裂球个数达到5个及以上),有效检出率达到100%,漏检率为0。对于第2、3、4、5组而言,有效检出率及漏检率各组间并无显著性差异(p0.05);而第一组与其它各组间,有效检出率及漏检率存在显著差异(p0.05)。结论:双重套式PCR可以有效扩增基因组DNA量约为12pg的模板,且扩增片段为单拷贝片段。 在OPS法冷冻胚胎双重套式PCR性别鉴定实验中,利用上述扩增体系对小鼠OPS法冷冻桑椹胚及新鲜桑椹胚进行性别鉴定。其中胚胎取样采用徒手取样法;OPS冷冻采用二步法(胚胎在10%E+10%D平衡液中预处理30s后,移入玻璃化溶液(EDFS30)中,平衡25s吸入OPS,直接投进液氮);解冻采用一步法(将OPS直接浸入37℃ 0.5mol/L蔗糖中,胚胎吹出后于新鲜蔗糖滴中,平衡5min,再将胚胎移入mCZB,置于37℃、5%CO_2、100%湿度培养箱中培养)。其中,共鉴定冷冻胚胎324枚,移植301枚胚胎于22只受体,其中11只妊娠,4只产仔,共产后代28只,都与鉴定性别一致;共鉴定新鲜胚胎256枚,移植232枚胚胎于16只受体,7只妊娠,3只产仔,共产后代21只,与性别鉴定结果相吻合。