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新孢子虫NcSRS2和NcSAG1基因及重组蛋白免疫原性的研究

余劲术  
【摘要】:新孢子虫病是多种动物共患的原虫病,对牛的危害最为严重。新孢子虫表面蛋白NcSRS2(Nc-p43),NcSAG1(Nc-p36)是介导新孢子虫黏附和入侵宿主细胞的主要表面蛋白,是最有希望的新孢子虫疫苗候选抗原和诊断抗原。本研究对NcSRS2基因进行了克隆和表达,并将该基因与NcSAG1基因融合实现共表达,同时初步研究了NcSRS2蛋白与NcSRS2-NcSAG1蛋白的免疫原性。 用分子生物学软件分析了NcSRS2,NcSAG1基因,截去NcSRS2基因中N端疏水部分后,将该基因(dNcSRS2)克隆至原核表达载体pGEX-6P-1构建重组质粒pGEX-dNcSRS2,在1mMIPTG诱导下,在大肠杆菌BL21中表达大量的目的蛋白(GST-dNcSRS2)。目的蛋白是以可溶性和包涵体两种形式存在,分子量是62.6KD,表达量为32.3%。用GST抗体进行Western blot检测,成功检测到特异性条带。用谷胱甘肽Sepharose 4B对融合蛋白进行纯化。 将NcSRS2和NcSAG1基因中抗原性较强的片段串联克隆到同一个原核表达载体pGEX-6P-1内,构建重组质粒pGEX-tNcP43-P36,以获取抗原性强的融合蛋白.在1mM的IPTG诱导下,目的蛋白(GST-tNcP43-P36)在大肠杆菌中以包涵体形式存在,分子量为64.5KD,表达量为14.9%。用抗GST血清进行Western blot检测,成功检测到特异性条带。在低蛋白浓度(0.042mg/ml)下进行梯度透析使变性重组蛋白获得较好的复性。 将纯化的GST-dNcSRS2蛋白和GST-tNcP43-P36蛋白三次免疫Balb/C小鼠,以检测两种蛋白的免疫原性。GST-dNcSRS2蛋白和GST-tNcP43-P36蛋白分别设高(100μg/只)、中 (50μg/只)、低(25μg/只)三个剂量并与弗氏佐剂混合免疫小鼠,另设GST-dNcSRS2蛋白和GST-tNcP43-P36蛋白两个中剂量组(不加佐剂)和对照组。分别于首次免疫前、每次免疫后10天采血、分离血清,ELISA测定血清抗体效价;三免后,各免疫组都获得了较好的抗体水平,尤其GST-dNcSRS2中剂量(加佐剂)免疫组最好。每次免疫后10天分离脾脏淋巴细胞,用MTT法做T淋巴细胞增殖试验表明GST-tNcP43-P36各剂量免疫组比GST-dNcSRS2各剂量免疫组具有较强的诱导小鼠细胞免疫反应的功能。


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