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羊痘病毒P32基因的克隆、表达及PCR诊断方法建立

丰素兰  
【摘要】:羊痘(绵羊痘和山羊痘)是由羊痘病毒属病毒引起的绵羊或山羊的一种急性、热性、接触性传染病,被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病,在我国被列为一类传染病。羊痘病毒P32蛋白是位于羊痘病毒膜表面的主要结构蛋白,含有中和抗原表位;羊痘病毒附着蛋白基因具有羊痘病毒属属特异性。 本研究利用PCR方法对羊痘病毒P32蛋白基因扩增,将回收PCR产物克隆到pGEM-T-Easy载体中,然后将P32蛋白基因分成3段,分别插入原核表达载体pGEX-4T-1中,经PCR和酶切鉴定,证明成功构建了重组表达载体pGEX-4T-1-N2/3、pGEX-4T-1-N1/3、pGEX-4T-1-M。经IPTG诱导,3个基因片段均在大肠杆菌表达系统中以包涵体的形式得到大量表达。表达蛋白N2/3、N1/3、M的分子量分别为52KDa、38KDa、40KDa。利用电洗脱方法对表达蛋白进行纯化,获得了理想的纯化结果。利用ELISA方法检测3个纯化重组表达蛋白活性,结果证明3种表达蛋白均与羊痘标准阳性血清有反应性。 针对羊痘病毒附着蛋白基因设计了一对引物,进行PCR扩增,扩增产物为192bp,经基因测序证实该片段为羊痘特异性附着蛋白基因片段。在优化PCR扩增条件的基础上,进行特异性和敏感性试验,初步建立了羊痘病毒的PCR检测方法。


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