苹果再生体系建立与MxIrt1基因功能的初步研究

【摘要】：以小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)及山定子(Malus baccata(L.)Borkh)组培苗为试材,建立了小金海棠及山定子离体叶片再生和转化体系,应用农杆菌介导转化法对其进行了遗传转化研究;在此基础上对MxIrtl基因功能进行初步探讨,并得出如下结果: 1、小金海棠适宜再生的培养基为MS+6-BA 4.0mg/L+NAA 1.0mg/L+TDZ 4.0mg/L,叶片再生频率可达90%以上,分析表明6-BA、NAA与TDZ三者之间有交互效应。山定子较容易再生,附加TDZ可提高山定子再生率,适宜再生的培养基为MS+6-BA 6.0mg/L+NAA 1.0mg/L+TDZ0.1mg/L,叶片再生频率可达85%以上。14-21d的暗培养有利于叶片再生,幼嫩叶片的再生效果远远高于中等及老化叶片,靠近叶柄的部分再生不定芽效果最理想。小金海棠叶片以向上放置最好,山定子对叶片放置方向不敏感。 2、Km在低浓度下即对不定芽再生产生影响,高浓度则完全抑制叶片再生,小金海棠再生Km筛选压为10-15mg/L,山定子再生Km筛选压为4-6mg/L,两者Hyg筛选压为1.0mg/L。Cef250mg/L不会影响叶片再生。 3、研究农杆菌菌株LBA4404及EHA105对苹果的GUS基因表达影响表明,EHA105菌株及2-3d的共培养时间较好,菌液浓度应在OD_(600)值0.5。 4、MxIrt1基因为小金海棠中克隆得到的Fe(Ⅱ)转运载体。构建小金海棠MxIrt1基因的植物表达载体pBIrt、pBIrtR、pBIrt-eGFP及pCWIrt,对苹果及烟草进行转化。经PCR及Southern鉴定,获得转化pCWIrt的烟草植株及转pBIrt的小金海棠植株。转基因烟草植株较之对照表现为叶片圆润,在缺铁胁迫下伴有生根量增加等特点。正常培养基中部分转基因烟草老叶出现斑点状枯斑现象。 5、构建与His-tag融合的MxIrt1基因原核表达载体,在30℃,IPTG 0.5mM下诱导7h可表达出相应40kD的蛋白条带。 6、Southern结果显示小金海棠及山定子均含有MxIrt1基因,且以多拷贝形式存在。PCR对苹果基因组DNA进行扩增后显示,MxIrt1基因至少含有一个内含子,长78bp。Northern杂交对MxIrt1基因在小金海棠及山定子中时空表达模式进行分析:MxIrt1基因在小金海棠部分器官中得以转录,但转录水平存在差异,嫩叶中表达水平偏低,花瓣中没有该基因的表达。