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葡萄果实中脱落酸激活的钙依赖蛋白激酶:纯化、测序及定位

李梅君  
【摘要】:脱落酸(ABA)是果实发育的一个重要调节因子,对其调控果实生长发育机制的研究,很重要的一方面是对其信号组分的鉴定。蛋白激酶所催化的蛋白质磷酸化过程在细胞信号转导中起关键的作用,因此,鉴定与ABA信号转导相关的蛋白激酶,对于揭示果实发育中ABA作用的细胞和分子机理具有重要意义。钙依赖的蛋白激酶(CDPK)是植物中特有的一种蛋白激酶,但是,据我们所知,目前ABA信号通路中CDPK的作用仍不清楚,所以,本研究具有更广泛的科学意义。 本实验应用胶内蛋白激酶自磷酸化分析表明,在葡萄果实微粒体中存在一种分子量约为62.5KD的钙依赖的蛋白激酶(CDPK),并且,外源ABA处理能激活这一蛋白激酶。由于CDPK和信号转导有关,是一种重要的信号分子,因此我们将实验的重点放在了这个蛋白激酶的纯化上。 制备葡萄果实微粒体,经过大量的SDS-PAGE电泳,将目的蛋白从胶上洗下来,低压冷冻干燥、富集,得到了电泳纯的目的蛋白。应用双向电泳(two-dimensional gel electrophoresis)鉴定纯化产物的纯度,结果表明纯化产物中存在着分子量相近,但等电点不同的两种蛋白;接着分别用葡萄果实中CDPK(VCPKl)的全长和N-端特异抗体与双向电泳分离后的蛋白发生免疫反应,对纯化产物进行进一步的鉴定,准确地将目的蛋白从纯化产物中鉴定并分离出来。应用串连质谱仪(LC-MS/MS)测定目的蛋白CDPK的蛋白酶解的氨基酸序列,得到了MAPDKPLDSAVLSR;VIAEGLSEEEIGGLR;LTAHEVLSHPWVVDDR;NNLNLGDVLGIPDMR等序列。依据序列在数据库中检索发现,纯化的蛋白激酶的序列和本实验室利用CDPK的保守序列设计简并引物,筛选葡萄cDNA文库得到的一个CDPK基因编码的蛋白(VCPKI)序列完全相同,因此断定二者是同一种蛋白。筛选得到的CDPK已在gene bank登录,注册的基因和蛋白的序列号分别是gi 39598579/gb AAR 28766.1。 从三个方面对这个蛋白进行了定位(1)生化水平的定位:用两相分配法分离膜系统,分别与葡萄VCPK1全长和N-端特异抗体发生免疫反应;(2)亚细胞水平的定位:利用胶体金免疫电镜定位:(3)分子水平定位:构建载体包含CaMV-35S promoter,GFP和VCPK1信息,转化E.coli分别在拟南芥叶片、洋葱下表皮及拟南芥原生质体中瞬时表达,利用激光共聚焦扫描显微技术(confocal laser scanning microscopy)CLSM观察定位结果。上述实验的结果表明:VCPK1主要位于细胞的质膜和叶绿体上,而在其他亚细胞区域和细胞质外空间没有发现。


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